一株耐萬古霉素糞腸球菌的分離鑒定

黃平容，田世成，蘇建明

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

糞腸球菌屬于過氧化氫酶陰性、無芽胞、兼性厭氧的革蘭陽性的單個或成鏈的球菌，也屬于能產(chǎn)生細菌素的乳酸菌［1］糞腸球菌。同時也是動物腸道正常菌群之一，常定居于動物腸道、口腔、生殖道，且廣泛分布于自然界中，通常不引起感染。自從20世紀80年代，第一株耐萬苦霉素糞腸球菌（vancoycin－resistant E.faecalis）被分離鑒定以來，糞腸球菌感染已居院內(nèi)感染第2位［2］。在歐洲、美國等國家嚴重威脅著人類公共健康以及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在中國也已在羊、豬等動物體內(nèi)分離到致病性糞腸球菌［3－4］。糞腸球菌對許多臨床常用抗生素具有固有耐藥性，并且能通過基因突變或者從供體菌中通過質粒、轉座子、基因盒－整合子系統(tǒng)等獲得外源遺傳物質，從而產(chǎn)生新的耐藥性，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)［5－6］。糞腸球菌通常引起傷口感染、尿道感染、腹腔感染、血流感染等，尤其見于免疫力低下或患有危重基礎疾病患者［7－8］。也可導致敗血癥、心內(nèi)膜炎等癥，病死率達21.0%～27.5%［9］。在獸醫(yī)臨床中，腸球菌引起的畜禽感染也日趨增多［10－12］。

本試驗從某豬場送檢發(fā)病豬臟器中分離出了一株耐萬古霉素糞腸球菌。在萬古霉素尚未投入使用的養(yǎng)殖業(yè)領域，這一結果呼吁急切規(guī)范中國獸藥使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 湖南某豬場送至湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院傳染病實驗室檢測的發(fā)病商品豬采取的病料。

1.1.2 主要試劑 TSB胰蛋白胨大豆肉湯為Sigma公司產(chǎn)品；藥敏紙片及標準菌株ATCC 29212為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；dNTP、TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL 5 000等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。兔鮮血培養(yǎng)基及其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 病原分離鑒定 從送檢病豬體內(nèi)取出心、肝、脾、肺、腎、腦等內(nèi)臟器官及關節(jié)液無菌劃線接種于兔鮮血培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24h后挑取單個菌落進行革蘭染色、鏡檢。將可疑菌落分別接種于含65g／L的NaCl和pH9.6的TSB液體培養(yǎng)基中于10℃及55℃進行培養(yǎng)，以進行細菌生長耐受性檢驗。

1.2.2 生化特性鑒定 生化試驗參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］，用分離菌的純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蕈糖、乳糖、蔗糖、水楊素、七葉苷、精氨酸、VP試驗、PYR、400mL／L膽汁、馬尿酸鹽等生化鑒定管中進行生化試驗。

1.2.3 PCR 鑒定 參照文獻［14］中已公布的16S rRNA保守區(qū)域設計的通用引物，上游引物：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；下游引物：5′－CGGTTACCTTGTTACGACTT－3′，預期擴增產(chǎn)物長度為1 500bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.4 DNA提取 采用常規(guī)方法提取細菌基因組，主要步驟如下：取液體培養(yǎng)物1mL置于1.5mL離心管中，10 000r／min離心30s，棄去上清，加入30μL滅菌去離子水，混勻，煮沸滅活5min～10 min，10 000r／min離心30s后吸取上清液，置于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR擴增 采用16SrRNA通用引物擴增16SrRNA保守區(qū)約1 500bp的目的片段。PCR反應 體 系：10×PCR buffer 5μL，dNTP （2.5 mmol／L）2.5 μL，上、下 游 引 物 各 1 μL（20 μmol／L），Taq酶（2.5U／μL）1μL，模板0.5μL，加超純水至50μL。反應條件為：95℃5min；94℃30s，59 ℃ 30s，72 ℃ 1min ，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。同時用蒸餾水取代模板作為陰性對照。取3 μL PCR產(chǎn)物，進行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀察、并用凝膠圖像系統(tǒng)拍攝，剩余PCR產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司純化、測序。測序結果進行Blast分析。

1.2.6 藥敏試驗 無菌取純化培養(yǎng)物涂布于TSB培養(yǎng)基上，待稍干后，將各種抗生素藥敏紙片平貼于其表面，放入37℃培養(yǎng)24h后用游標卡尺量取抑菌圈直徑，并采用NCCLS（美國臨床實驗室標準化委員會）2005版標準進行結果判定。

2 結果

2.1 細菌培養(yǎng)結果

取平板培養(yǎng)物進行革蘭染色、鏡檢，為革蘭陽性球菌，多成雙球狀排列，亦有少數(shù)為單個存在；在液體培養(yǎng)基中，多以長鏈狀形態(tài)存在。在TSB平板上經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)18h～24h后形成直徑0.1mm～1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落。在血平板上能形成β溶血環(huán)。

2.2 生化試驗結果

將分離純化菌株接種于生化培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h觀察結果。其結果符合腸球菌生化特性（表1）。

表1 分離菌生化特性試驗結果Table 1 The results of biochemical test

2.3 PCR鑒定結果

16SrRNA通用引物擴增產(chǎn)物經(jīng)過含有EB的瓊脂糖進行鑒定，能得到明顯的約1 500bp的條帶（圖1），與預期目的片段大小一致。擴增產(chǎn)物測序結果導出序列后進行Blast分析，與已鑒定的糞腸球菌同源性為99%，根據(jù)菌種基因組保守區(qū)間的差異標準，可確定該菌株為糞腸球菌。

2.4 藥敏試驗

測定了該菌對米諾霉素（30μg／片）、苯唑青霉素、四環(huán)素（30μg／片）、環(huán)丙沙星（5μg／片）、紅霉素（15μg／片）、左氧氯沙星（5μg／片）、青霉素G（10萬單位）、萬古霉素（30μg／片）、氯霉素（30μg／片）九種抗生素的耐藥性（表2），顯示該菌株對于所有本試驗測定的藥物均耐藥，表明該菌已產(chǎn)生多重耐藥性，尤其對于臨床尚未使用的萬古霉素亦為耐藥。

圖1 PCR擴增結果Fig.1 The results of PCR amplification

圖2 16SRNA測序結果Fig.2 The results of 16SRNA sequencing

表2 分離株對不同抗菌藥的耐藥性Table 2 Drug resistance of E.faecalis isolates

3 討論

糞腸球菌本是溫血動物腸道正常菌群，一般情況不會引發(fā)疾?。?5］，所以糞腸球菌感染沒有季節(jié)性，多是由于宿主免疫力下降，如長途運輸、飼料更替、天氣變化、斷奶、飼養(yǎng)密度過大等因素而導致感染，且多為混合感染［16］。目前，沒有任何有效的疫苗或其他預防措施能預防糞腸球菌的感染，這給糞腸球菌病的臨床冶療帶來了極大的困難。本試驗從臨床發(fā)病豬肺部分離出糞腸球菌，通過藥敏試驗測定，該菌株為多重耐藥菌株，且對于獸醫(yī)臨床極少使用的萬古霉素也表現(xiàn)為耐藥。研究表明，糞腸球能從供體細菌基因組中，通過轉座子、質粒、基因盒－整合子系統(tǒng)、插入序列等多種方式獲得外源基因并整合到自身基因組中，從而表現(xiàn)出相應的表型［5－6］。糞腸球菌耐藥基因在細菌間的傳播，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，并給臨床治療帶來極大的因難。然而，許多對獸醫(yī)臨床病原菌的耐藥性監(jiān)測卻忽略了糞腸球菌。

獸藥在防治動物疾病、提高生產(chǎn)性能、改善畜產(chǎn)品質量方面起著十分重要的作用，但濫用獸藥，濫用飼料添加劑，不僅對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重威脅，污染農(nóng)產(chǎn)品和生產(chǎn)環(huán)境，也可引起二次污染，從而使細菌耐藥性不斷增加，造成嚴重的經(jīng)濟損失。本次在湖南地區(qū)檢出萬古霉素耐藥糞腸球菌菌株證明了湖南地區(qū)存在耐萬古霉素糞腸球菌。更重要的是抗生素耐藥基因在細菌的傳播后，攜帶耐藥基因的細菌，尤其是糞腸球菌可能通過食物鏈或是其他接觸，導致人類感染，給人類健康構成極其嚴重的威脅。

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