犬細(xì)小病毒VP2基因測序分析

李世靜，嵇辛勤，2＊，主 性，阮 涌，傅心亮，王修江

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州貴陽550025；3.貴陽市黔靈動(dòng)物醫(yī)院，貴州貴陽550004）

犬細(xì)小病毒?。–anine parvovirus disease）是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬的一種急性傳染病，以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為特征，多發(fā)生于幼犬，病死率10%～50%［1］。犬細(xì)小病毒最早是在1977年由美國學(xué)者Eugster和Nain從患出血性腸炎的病犬糞便中首次觀察到的［2］，我國于1982年由徐漢坤等首次報(bào)道本病的流行。到目前為止，犬細(xì)小病毒有 CPV－2、CPV－2a、CPV－2b、CPV－2c（a）和 CPV－2c（b）5個(gè)亞型［3］。在我國，CPV－2曾在20世紀(jì)80年代早期流行，但1986年后全國范圍內(nèi)主要以CPV－2a占優(yōu)勢地位。2009年杜強(qiáng)等［4］用貓腎（F81）細(xì)胞分離鑒定出一株細(xì)小病毒為CPV－2a亞型。近年來，該病的診斷方法層出不窮，姜騫等［5］利用重組蛋白建立了間接ELISA檢測方法，具有良好的特異性，與常見的犬病毒性傳染病陽性血清無交叉反應(yīng)，重復(fù)性良好，與商品化的試劑盒符合率高達(dá)96.5%，該方法具有較好的市場前景。林穎等［6］根據(jù)GenBank中犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒基因序列個(gè)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用雙重PCR方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測，從而建立了一種能夠進(jìn)行鑒別檢測犬細(xì)小病毒和犬冠狀病毒的雙重PCR方法。溫海等［7］根據(jù)CPV的VP2基因序列，設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物，對(duì)36份臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陽性檢出率為80.5%（29／36），檢出率高于普通 PCR72.2%（26／36），從而建立了一種利用LAMP檢測犬細(xì)小病毒感染的新方法。

CPV基因組主要編碼4種蛋白（VP1、VP2、NS1、NS2），其中VP1和VP2為結(jié)構(gòu)蛋白。VP2是構(gòu)成衣殼蛋白的主要組分，是病毒重要的抗原性蛋白，在誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)和病毒感染的過程中占主導(dǎo)地位，病毒的遺傳變異也主要體現(xiàn)在此蛋白序列中［8］。CPV的中和抗原位點(diǎn)位于VP2上，VP2蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。CPV VP2基因全長1 755bp，編碼584個(gè)氨基酸，其基因序列決定著抗原和宿主的特異性。CPV容易產(chǎn)生新的突變株，其原因在于VP2基因的N端以及該基因上的蛋白轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)區(qū)loop1和loop3是重要的B細(xì)胞抗原表位區(qū)，這些區(qū)域氨基酸殘基的變化會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)抗原漂移［9－11］。

為了解貴陽市CPV VP2基因變異情況，本研究選擇CPV的VP2基因作為研究對(duì)象，采用PCR方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并將測序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，為貴州省犬細(xì)小病毒病的防控提供理論依據(jù)及CPV新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 試驗(yàn)糞便樣本采集：經(jīng)美國衡健犬細(xì)小病毒抗原快速檢測試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)：HG02－233）檢測為陽性患犬糞便樣本13份，均來自于貴陽市黔靈動(dòng)物醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑 10×PCR buffer、Taq DNA 聚合酶為天根生物工程有限公司產(chǎn)品；dNTPs、DNA Marker DL 2 000、Goldview核酸染料均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；CPV抗原快速檢測試劑盒為美國衡健生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA／RNA小量試劑盒為?？瞪萍加邢薰井a(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品試劑盒檢測 臨床上采用試劑盒對(duì)疑似患犬的檢樣進(jìn)行檢測，步驟見說明書。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中報(bào)道的CPV VP2基因的核酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，其中上游引物為 CPV VP2（F1）：5′－TGC CAG AAA GTG AAA ATT ATA G －3′；下 游 引 物 為CPV VP2（F2）：5′－TAG TAG CTT CAG TAA TAT AGT T－3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為771bp。

1.2.3 樣本DNA的提取及PCR方法的建立 用無菌生理鹽水對(duì)糞樣進(jìn)行處理，按照DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA。以提純的CPV DNA 4μL為模板，上、下游引物各2μL，10×PCR buffer 5μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶2μL，MgCl23μL，去離子水30μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?6℃3min；95℃30s，53℃30s，72℃80s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，拍照。

1.2.4 序列測定及分析 將PCR陽性DNA送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。對(duì)本試驗(yàn)中3個(gè)測序結(jié)果的VP2基因序列進(jìn)行比較，通過Blast從GenBank中截取的7個(gè)參考序列，經(jīng)DNA Star進(jìn)行序列編輯，將7個(gè)參考序列與測序結(jié)果一同通過DNA Star軟件進(jìn)行同源性比較，并對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢測結(jié)果

陽性患犬基本信息見表1?；既颈憩F(xiàn)：病犬大多精神萎頓，鼻鏡干燥，體溫平均升高2℃～3℃，部分患犬流清鼻涕，有少量眼屎；初期無故干嘔，后逐步發(fā)展為嘔吐胃內(nèi)容物及便血，重癥者表現(xiàn)為嚴(yán)重脫水癥狀。

表1 患犬基本信息Table 1 The basic information of affected puppies

2.2 CPV VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期片段大小（771bp）相符（圖1、圖2）。

2.3 VP2基因測序結(jié)果

本研究隨機(jī)挑選3個(gè)陽性PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，結(jié)果用DNA Star處理后見圖3。

圖1 犬CPV VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of VP2gene of canine by PCR

圖2 犬CPV VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of VP2gene of canine by PCR

圖3 3株試驗(yàn)株核苷酸序列比較結(jié)果Fig.3 The comparison of 3strain nucleotide sequences

3個(gè)試驗(yàn)株相比較而言，CPV－ZA在12、13、24、25、26位出現(xiàn)堿基缺失，相對(duì)于CPV－TD（1）而言，第1位由A→T，第5位由T→A，第16位由A→T，第21位由A→G，第22位由T→G，第29位由T→A。CPV－TD（1）相對(duì)于另外2株則在1、6、12、13、21、22、29、751位上出現(xiàn)改變。CPV－TD（2）則在1、9、10、11、12、13、29、46、744、751位發(fā)生堿基的缺失，而相對(duì)于CPV－ZA 而言，則在1、2、4、5、16、21、23位發(fā)生堿基改變，這些堿基的改變和缺失是導(dǎo)致3株試驗(yàn)株同源性不能達(dá)到100%的最重要的原因。

2.4 VP2核苷酸序列同源性比較

將檢測出來的3株［CPV－TD（1）、CPV－TD（2）、CPV－ZA］犬細(xì)小病毒VP2基因的核苷酸序列與GenBank上登錄的7株（國外分離株：CPV－15、CPV－31、CPV－39、CPV－133、CPV－b；國內(nèi)分離株：B－2004、CPV－GN）犬細(xì)小病毒流行株經(jīng)過DNA Star軟件推導(dǎo)分析出不同毒株之間的同源性（表2）。表右上方為核苷酸同源性，左下方為核苷酸的差異度。從表2可看出，3個(gè)試驗(yàn)毒株的VP2基因核苷酸序列之間存在較高的同源性可達(dá)96.5%～97.3%；與7株參考毒株的同源性可達(dá)95.2%～96.8%。

2.5 進(jìn)化樹分析結(jié)果

為進(jìn)一步分析3個(gè)試驗(yàn)毒株與國內(nèi)外流行毒株在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系，將試驗(yàn)株與參考毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建（圖4）。

依據(jù)進(jìn)化樹可看出，試驗(yàn)毒株之間存在著一定的親緣性，與參考毒株之間的同源性不盡相同，其中以CPV－TD（2）與國內(nèi)外流行毒株之間親緣性最近，CPV－TD（1）與參考毒株之間的親緣性較遠(yuǎn)，而CPV－ZA與參考毒株的親緣性介于CPV－TD（2）和CPV－TD（1）之間。

表2 VP2基因的核苷酸序列同源性比較結(jié)果Table 2 The comparison of CPV VP2nucleotide sequence homology

圖4 CPV VP2基因進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree for CPV VP2gene based on nucleotide sequences

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的成熟，為CPV的檢測提供了更為可靠的方法。本研究采用兩種不同檢測方法同時(shí)對(duì)犬細(xì)小病毒病進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示符合率高達(dá)76.9%。從二者符合率來看，試劑盒的靈敏性較高，但仍可能出現(xiàn)假陽性，這和患犬本身帶毒量有關(guān)。該病自然潛伏期為7d～14d，潛伏期的不同階段，犬的帶毒量均不同，這給臨檢帶來了一定的困難。現(xiàn)階段CPV的遺傳變異分析和基因進(jìn)化樹的構(gòu)建主要依據(jù)VP2基因，本研究選用了CPV的VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行同源性和進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果表明，3個(gè)試驗(yàn)毒株VP2基因核苷酸序列之間同源性高達(dá)96.5%～97.3%；與7株參考毒株同源性可達(dá)95.2%～96.8%；3個(gè)試驗(yàn)毒株與國內(nèi)外流行毒株存在一定親緣性?？沙醪酵茢嗳?xì)小病毒病在貴州省廣泛流行很有可能是由外地傳入，但從目前犬細(xì)小病毒病的變異趨勢來看，貴州省是否存在CPV的遺傳變異情況，還需要更進(jìn)一步的深入研究。

近年來，寵物犬的數(shù)量逐年遞增，給CPV的防控帶來了一定的壓力，CPV發(fā)病率也逐年呈上升趨勢。目前，針對(duì)CPV主要采用防制為主的原則，對(duì)其防控是以弱毒疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，但弱毒疫苗在使用過程中也常出現(xiàn)一系列問題，如能引起免疫抑制、散毒和發(fā)生毒力返強(qiáng)及母源抗體干擾等［12］，從而導(dǎo)致免疫失敗。筆者認(rèn)為免疫失敗可能存在兩個(gè)最主要原因：①防疫措施不到位，或者根本就沒有進(jìn)行任何疫苗的接種；免疫預(yù)防要取得滿意結(jié)果，平時(shí)就必須嚴(yán)格執(zhí)行獸醫(yī)衛(wèi)生防疫措施，堅(jiān)持進(jìn)行免疫注射，但免疫的程序與時(shí)機(jī)等因素都會(huì)影響幼犬的免疫效果［13］。②當(dāng)?shù)氐牧餍卸局臧l(fā)生了新的變異從而導(dǎo)致免疫失敗。隨著變異毒株的不斷出現(xiàn)，我國近年也首次報(bào)道出現(xiàn)CPV－2c的感染［14］，證實(shí)在中國除了優(yōu)勢毒株CPV－2a和CPV－2b流行外，又新出現(xiàn)了CPV－2c，表明CPV在不斷地變異。CPV毒株的變異具有重要的生物學(xué)意義，除了導(dǎo)致現(xiàn)有的弱毒疫苗免疫失敗，還極有可能導(dǎo)致動(dòng)物感染譜的擴(kuò)大，尤其對(duì)野生動(dòng)物存在潛在的威脅［15］。

因此，針對(duì)貴陽市的CPV分子流行病學(xué)調(diào)查研究，對(duì)于控制該病在貴陽市的流行就顯得非常有必要。本研究通過對(duì)3個(gè)試驗(yàn)毒株VP2基因的序列分析與比對(duì)，對(duì)貴陽市CPV變異情況有了初步了解，可為貴陽市CPV的診斷以及防控措施提供重要參考。

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