NADPH氧化酶在腫瘤壞死因子-α致乳鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用

蘇興利 張 鴻 王 爽 霍 健 郭玉芳 王 湘

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

各種病因?qū)е碌男牧λソ呤抢夏耆怂劳龅闹饕?，腫瘤壞死因子(TNF)-α在心臟疾病細(xì)胞因子假說中具有重要的地位，心肌組織可以產(chǎn)生內(nèi)源性TNF-α，心肌細(xì)胞、局部巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞都可以合成〔1〕。Yokoyama等〔2〕給予體外培養(yǎng)的成年貓心肌細(xì)胞TNF-α，心肌細(xì)胞蛋白合成增加了2.4倍。TNF-α的促心肌細(xì)胞肥大作用后來也被其他學(xué)者所證實(shí)。心衰患者循環(huán)中TNF-α的增加被認(rèn)為是導(dǎo)致心臟功能降低，增加心衰致死率的主要因素?；钚匝?ROS)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)ROS參與了心肌細(xì)胞肥大和凋亡，NADPH氧化酶是心肌組織ROS的主要來源。AngⅡ可通過NADPH氧化酶途徑促進(jìn)新生大鼠心肌細(xì)胞ROS生成并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白合成〔3〕。TNF-α是否也由NADPH氧化酶源性ROS介導(dǎo)了心肌細(xì)胞肥大，目前尚未有報道。本研究在體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，探索NADPH氧化酶在TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用，旨在進(jìn)一步揭示TNF-α致心肌肥大的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD乳鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基、TRIzol(Gibco公司)，TNF-α(R＆D 公司)，夾竹桃麻素(apocycin，APO)、胰酶(Sigma公司)，p22phox兔抗鼠抗體(Santa Cruz公司)，RT-PCR試劑盒(TaKa-Ra公司)，α-actin抗體、SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海生工公司)，RIPA裂解液、活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司)，Image-Pro plus 6.0圖像處理軟件(美國Media Cybernetics公司)。

1.2 乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 出生2 d的SD大鼠，無菌取心室肌，反復(fù)剪碎，用1.25 g/L胰酶和1 g/LⅡ型膠原酶消化。收集細(xì)胞懸液，過濾，以1 000 r/mim離心5 min。用100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。用差速貼壁法分離心肌細(xì)胞，置于50 ml/L CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞可出現(xiàn)搏動，免疫細(xì)胞化學(xué)抗α-actin染色鑒定心肌細(xì)胞的純度。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4組，每組6孔(n=6)，即正常對照組(A組)，TNF-α 組(B組 80 ng/ml)，APO組 (C組100 μmol/L)和 TNF-α +APO 組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 心肌細(xì)胞蛋白的BCA法測定 將心肌細(xì)胞以5×105個細(xì)胞/ml的密度接種于24孔板中，每組6孔，孵育48 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每孔加入RIPA裂解緩沖液100 μl，充分接觸細(xì)胞，冰浴下作用5 min后收集心肌細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，于4℃離心30 min。取上清液，按檢測試劑盒的說明操作，計算每孔心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS的測定 DCHF-DA可以自由穿過細(xì)胞膜，被胞內(nèi)酯酶水解生成DCHF，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，通過熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)的活性氧的水平。將各組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基稀釋的10 μmol/L DCFHDA避光孵育37℃ 20 min，無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，攝像。用Image-Pro plus6.0軟件對圖像進(jìn)行分析，以平均光密度反應(yīng)ROS的相對含量。

1.6 RT-PCR檢測p22phox mRNA的表達(dá) 采用TRIzol法提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以 Oligo(dT)18為引物，在20 μl體系中合成cDNA。以各組cDNA為模板，分別加入大鼠p22phox上、下游引物進(jìn)行PCR，GAPDH作為內(nèi)參照。p22phox上游引物為:5'-TCCACTTACTGCTGTCCGT-3'，下游引物為:5'-TCAATGGGAGTCCACTGCT-3'。GAPDH 上游引物為:5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物為:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。25 μl體系反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 3 min，94℃ 變性 30s，退火 53℃ (p22phox 基因)，56℃(GAPDH基因)30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)后，于72℃再延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Chemi-Genius Bio照相系統(tǒng)(Syngene，Cambridge，U.K.)采集圖像并進(jìn)行分析。以樣品RNA為模板擴(kuò)增時未見條帶。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測p22phox表達(dá) 制作各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞爬片，經(jīng)多聚甲醛固定，PBS充分漂洗，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗(p22phox兔抗鼠多克隆抗體，1∶100)，濕盒中4℃過夜，滴加二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。Nikon E200顯微鏡照相，鏡下觀察攝像，陰性對照以PBS代替一抗。每組隨機(jī)選取至少5個高倍視野采集數(shù)碼照片，用Image-Pro plus6.0圖像處理軟件進(jìn)行分析，以平均光密度反應(yīng)免疫陽性產(chǎn)物含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS15.0軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用ANOVA方差分析。

2 結(jié)果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的鑒定及純度 倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，貼壁后細(xì)胞為多角形，搏動效果較好，抗α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性率大于95%，說明培養(yǎng)細(xì)胞主要為心肌細(xì)胞，細(xì)胞純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 心肌細(xì)胞蛋白合成檢測結(jié)果 給予心肌細(xì)胞80 ng/ml TNF-α作用48 h后，心肌細(xì)胞蛋白合成與對照組比較，增加了65.8%(P＜0.01)，顯微鏡下觀察，細(xì)胞體積增大，說明TNF-α具有刺激心肌細(xì)胞蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞肥大的作用。AOP單獨(dú)作用，對心肌細(xì)胞蛋白合成無明顯影響，但可將TNF-α促心肌細(xì)胞蛋白合成降低89.8%(P＜0.01)。提示TNF-α的作用可能與增強(qiáng)NADPH氧化酶活性有關(guān)。

2.3 心肌細(xì)胞活性氧水平檢測結(jié)果 圖1所示，TNF-α作用心肌細(xì)胞后，與對照組比較，綠色熒光明顯增強(qiáng)，ROS含量增加61%(P＜0.01)，APO作用后，熒光較對照組略強(qiáng)。APO可將TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的作用降低84.6%(P＜0.01)，提示TNF-α致心肌細(xì)胞肥大作用可能與NADPH氧化酶介導(dǎo)ROS產(chǎn)生有關(guān)。

2.4 心肌細(xì)胞p22phox mRNA表達(dá)結(jié)果 如圖2所示，TNF-α作用心肌細(xì)胞后，NADPH氧化酶亞基p22phox mRNA表達(dá)水平明顯增加，與對照組比較，表達(dá)水平增加65.4%(P＜0.01)，APO組p22phox mRNA表達(dá)水平略有下降，APO可明顯逆轉(zhuǎn)TNF-α對p22phox mRNA表達(dá)的影響(P＜0.01)。說明TNF-α可能通過上調(diào)p22phox基因表達(dá)介導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。

圖1 各組心肌細(xì)胞ROS生成比較

2.5 心肌細(xì)胞p22phox蛋白表達(dá)結(jié)果 圖3可見，TNF-α作用心肌細(xì)胞后，NADPH氧化酶亞基p22phox蛋白表達(dá)水平明顯增加，與對照組比較，表達(dá)水平增加112.3%(P＜0.01)，APO可將TNF-α促p22phox表達(dá)作用降低91.2%(P＜0.01)。進(jìn)一步提示TNF-α通過上調(diào)NADPH氧化酶亞基p22phox表達(dá)水平介導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。

圖2 各組心肌細(xì)胞NADPH氧化酶亞基p22phox mRNA表達(dá)

圖3 各組心肌細(xì)胞NADPH氧化酶p22phox蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

近年來實(shí)驗(yàn)和人體研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶來源的ROS在心血管重塑中具有重要作用。NADPH氧化酶是多種蛋白酶的復(fù)合物，可通過催化電子從NADPH轉(zhuǎn)移至分子氧而產(chǎn)生超氧化物。根據(jù)催化亞基的不同，分為5種亞型，分別是Nox1～Nox5。Nox1、Nox2和Nox4在心血管細(xì)胞表達(dá)。與其他來源的ROS，如線粒體、黃嘌呤氧化酶和解偶聯(lián)的 NO合酶相比較，NAPDH氧化酶主要被特異的激動劑刺激后產(chǎn)生ROS，特別是AngⅡ、ALD、TNFα、TGFβ、PDGF 和機(jī)械應(yīng)力〔4〕。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NADPH氧化酶來源的ROS在內(nèi)皮功能障礙、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、RAAS相關(guān)的高血壓和缺血性血管重塑中發(fā)揮重要作用〔5〕。TNF-α是一種具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，在炎癥、細(xì)胞生存、生長、分化和凋亡等生理和病理過程中具有重要作用〔6〕。結(jié)合文獻(xiàn)報道和我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織中TNF-α的濃度升高，并伴隨心肌細(xì)胞肥大，提示在壓力應(yīng)激下，TNF-α可能以自分泌、旁分泌的方式參與了超負(fù)荷下的心肌重構(gòu)〔7〕。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNF-α呈濃度依賴性的刺激乳鼠心肌細(xì)胞蛋白合成，心肌細(xì)胞體積增大。而且TNF-α還可促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)源性分泌AngⅡ，促進(jìn)心肌細(xì)胞AT1受體表達(dá)增加，提示TNF-α和AngⅡ都參與了心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞，通過NADPH氧化酶p22phox亞基促進(jìn)ROS產(chǎn)生，可能參與了心肌組織病變的發(fā)生〔8〕。在壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)NADPH氧化酶源性的ROS參與了心肌肥大的發(fā)生〔9〕。由此提示心肌組織ROS的產(chǎn)生與心肌肥大病變存在密切關(guān)系。TNF-α作用于培養(yǎng)的動脈平滑肌細(xì)胞，NADPH氧化酶亞基p22phox mRNA表達(dá)增加，ROS生成明顯增多，應(yīng)用反義p22phox cDNA轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，則TNF-α不能引起ROS的產(chǎn)生增加〔10〕，這說明TNF-α是通過 p22phox表達(dá)增加導(dǎo)致NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，而介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可刺激乳鼠心肌細(xì)胞蛋白合成增加，ROS生成增多，引起心肌細(xì)胞肥大，應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑可逆轉(zhuǎn)TNF-α的作用，說明TNF-α通過心肌NADPH氧化酶活性增加導(dǎo)致心肌ROS生成介導(dǎo)了心肌細(xì)胞肥大。通過基因水平和蛋白水平的研究提示，NADPH氧化酶活性的增強(qiáng)可能與其亞基p22phox高表達(dá)有關(guān)。從而表明TNF-α可能是通過增加心肌細(xì)胞NADPH氧化酶亞基p22phox表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，引起心肌組織ROS生成，從而介導(dǎo)了心肌細(xì)胞肥大，參與了氧化應(yīng)激下的心肌重塑。

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