胰島素對(duì)促性腺激素釋放激素分泌及活性的調(diào)控

朱宇旌 丁 蘭 張 勇* 王 艷 張寶生

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866;2.凌源禾豐牧業(yè)有限責(zé)任公司，凌源 122500)

動(dòng)物的能量代謝狀況對(duì)動(dòng)物的繁殖性能有重要影響，能量代謝狀況如果發(fā)生變化，動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)繁殖的激素就會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化。胰島素(insulin，Ins)是動(dòng)物體內(nèi)能量代謝調(diào)控的重要激素。促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是動(dòng)物體內(nèi)調(diào)控繁殖的重要激素，是使動(dòng)物發(fā)情的起始因素。雖然連接能量平衡和繁殖力的細(xì)胞及分子機(jī)制還不是很清楚，本文綜述了胰島素做為重要的代謝調(diào)控胞外信號(hào)，其對(duì)下丘腦中重要的啟動(dòng)生殖的激素GnRH的活性和作用的影響。近年來的研究表明，胰島素影響GnRH分泌通過如下3條途徑:1)早期生長應(yīng)答蛋白-1(early growth response protein 1，Egr-1)途徑，在胰島素存在下，Egr-1可與GnRH啟動(dòng)子結(jié)合，提高啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)GnRH基因表達(dá)[1];2)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑，GnRH在垂體促進(jìn)促黃體素(luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH)分泌時(shí)主要依靠ERK作用，而胰島素可影響ERK的活性，從而間接促進(jìn)GnRH 基因表達(dá)[2-3];3)神經(jīng)肽 Y(NPY)途徑，NPY可以刺激或抑制GnRH脈沖發(fā)生器，而胰島素可以調(diào)節(jié)NPY的活性[4-5]。

1 GnRH分泌與胰島素的關(guān)系

哺乳動(dòng)物的生殖周期是由下丘腦、腦垂體和生殖腺之間復(fù)雜的相互作用控制的;中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種內(nèi)分泌激素協(xié)同作用，才能啟動(dòng)母畜發(fā)情。動(dòng)物生長發(fā)育到一定階段，下丘腦對(duì)性腺類固醇激素敏感性降低，使GnRH合成和分泌增加，同時(shí)腦垂體和性腺對(duì)GnRH的敏感性增加，LH和FSH分泌，這二者作用于性腺促進(jìn)雌二醇和孕酮分泌，動(dòng)物發(fā)情被啟動(dòng)[6]?？梢钥闯觯谡麄€(gè)啟動(dòng)過程中，GnRH起到重要作用。

GnRH為10肽小分子，由下丘腦視交叉前區(qū)的GnRH神經(jīng)元分泌，然后從正中隆起進(jìn)入垂體門靜脈系統(tǒng)，隨血液進(jìn)入垂體，刺激垂體細(xì)胞分泌LH和FSH[7]。GnRH呈脈沖式分泌，其分泌模式對(duì)外界信號(hào)非常敏感，例如限飼、環(huán)境溫度過高或過低、過度使役等都會(huì)輕易抑制GnRH的脈沖式分泌。但是當(dāng)外界刺激消除后，GnRH脈沖分泌只需1～2 h就會(huì)恢復(fù)。

胰島素是動(dòng)物體能量代謝調(diào)節(jié)的重要胞外信號(hào)，也是連接機(jī)體代謝變化與繁殖機(jī)能調(diào)整的重要信使。胰島素可以通過血腦屏障，直接作用于下丘腦，將能量代謝狀況信息傳遞至下丘腦。Woods等[8]最早研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胰島素血液循環(huán)水平與機(jī)體脂肪沉積成比例，從而提出胰島素在能量平衡中起重要作用。用基因打靶技術(shù)使小鼠胰島素受體特異性神經(jīng)元表達(dá)沉默可導(dǎo)致小鼠體脂沉積增加和GnRH釋放減少，下丘腦的促性腺功能減退，最后出現(xiàn)不育[9]。因此推測胰島素在動(dòng)物繁殖過程中發(fā)揮重要作用，這些作用有可能是胰島素直接促進(jìn)GnRH分泌釋放，也可能是間接作用于其他途徑最終影響GnRH分泌釋放。

2 胰島素對(duì)GnRH分泌釋放的調(diào)控

2.1 胰島素促進(jìn)GnRH基因表達(dá)的Egr-1途徑

Egr-1基因是即早基因家族的成員，是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，該家族還包括c-jun、核轉(zhuǎn)錄因子кB(NF-кB)、c-fos、Egr-2、Egr-3、Egr-4 等基因[10]。這些基因在被生長因子、細(xì)胞因子和損傷刺激后迅速而瞬時(shí)地誘導(dǎo)表達(dá)，故稱為即早基因家族[11]。Egr-1基因受到誘導(dǎo)后，其鋅指DNA結(jié)合區(qū)域能與靶基因中富含鳥嘌呤胞嘧啶的順式作用元件結(jié)合[12]，其生物學(xué)功能主要是激活或抑制這些靶基因表達(dá)[13]。因此一旦Egr-1基因與DNA結(jié)合，其相互作用可以表現(xiàn)為共激活或共抑制。

胰島素在許多組織中包括肝臟、骨骼、胰腺β細(xì)胞及血管內(nèi)皮組織細(xì)胞中均可調(diào)節(jié)Egr-1基因表達(dá)[14]。Sara等[1]首次使用體外模型 GN11 細(xì)胞系證明了Egr-1基因在胰島素增加GnRH基因表達(dá)中起到重要作用。在GN11細(xì)胞系中，在使用胰島素處理30 min后，Egr-1 mRNA水平顯著提高;在處理60 min后，Egr-1蛋白和GnRH mRNA水平顯著提高。其結(jié)論是胰島素存在時(shí)，Egr-1基因與GnRH基因啟動(dòng)子的近側(cè)區(qū)的富集鳥嘌呤與胞嘧啶區(qū)域即-75～-67 bp結(jié)合，改變GnRH基因啟動(dòng)子的活性，從而增加GnRH基因表達(dá)(圖1)。GN11細(xì)胞系是一種永生的GnRH分泌型神經(jīng)元細(xì)胞系。雖然在體外研究中無限增殖的細(xì)胞并不能代表體內(nèi)的反應(yīng)，但是在GnRH合成和釋放的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中，這種永生的細(xì)胞系的價(jià)值已經(jīng)被證實(shí)是有重要意義的[15-16]。

在體外細(xì)胞模型研究中，Kim等[17]首先證明了胰島素在GnRH神經(jīng)元細(xì)胞系中直接作用于GnRH神經(jīng)元，促進(jìn)GnRH基因表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)胰島素刺激絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)基因表達(dá)是胰島素促進(jìn)GnRH分泌的原因，但是胰島素對(duì)MAPK基因的作用機(jī)理還不清楚[18]。有研究證明由胰島素誘導(dǎo)的Egr-1基因表達(dá)首先是由MAPK激酶(MEK)途徑介導(dǎo)的，在Egr-1基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)和 p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)途徑起到一個(gè)調(diào)整作用，但并不是本質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[19]。使用MAPK特異性抑制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理之后，胰島素誘導(dǎo)的Egr-1基因轉(zhuǎn)錄被完全抑制。相反，使用PI3K特異性抑制劑預(yù)處理后，由胰島素誘導(dǎo)的Egr-1基因轉(zhuǎn)錄并沒有明顯變化[1]。因此確定，胰島素誘導(dǎo)Egr-1基因轉(zhuǎn)錄是通過MAPK途徑進(jìn)行的。

圖1 胰島素通過Egr-1影響GnRH分泌過程Fig.1 The secretion of GnRH affected by Ins through Egr-1

2.2 胰島素影響GnRH活性的ERK途徑

ERK是MAPK的家族成員之一，ERK廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可對(duì)多種細(xì)胞外刺激發(fā)生反應(yīng)，是將哺乳動(dòng)物細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)并激活一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)ERK可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成等影響神經(jīng)細(xì)胞增殖分化及軸突生長，并參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[20]。小鼠垂體ERK1、ERK2基因雙敲除后，雌性小鼠由于LH合成缺乏會(huì)導(dǎo)致排卵故障甚至不育，雄性小鼠表現(xiàn)輕微LH分泌不足，但對(duì)其繁殖力無明顯的影響[21]。

LH是由α亞基和β亞基組成的異二聚體糖蛋白，其中β亞基決定其特異性[20]。下丘腦分泌的GnRH與腦垂體GnRH受體結(jié)合后，刺激促性腺激素LH和FSH的分泌。同時(shí)，GnRH在垂體促性腺物質(zhì)細(xì)胞中還通過激活ERK誘導(dǎo)LHβ亞基和FSHβ亞基的基因表達(dá)[2]，促進(jìn)二者生物合成，增加LH和FSH的合成。

在促性腺物質(zhì)分泌細(xì)胞中，GnRH與位于細(xì)胞膜上的特定微區(qū)域即脂筏結(jié)構(gòu)[22]上的受體結(jié)合，該受體對(duì)該脂筏結(jié)構(gòu)有特殊親和力[23]。GnRH與受體結(jié)合后，通過G蛋白 α亞基 q/11亞型(Gαq/11)即可激活磷脂酶 C(phospholipase C，PLC)。Gαq/11與配體結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生改變，其 α亞基和γ、β亞基組成的二聚體從受體上分離出來。分離出的α亞基可以調(diào)整許多酶的效應(yīng)器以及制造第2信使1，4，5-三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)和甘油二酯(DAG)[24]。α亞基使磷脂酰肌醇4，5二磷酸(phosphatidylinositol 4，5-diphosphate，PIP2)分解，產(chǎn)生 IP3和 DAG。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面上的IP3受體結(jié)合直接誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放到胞質(zhì)中，隨著這個(gè)始發(fā)信號(hào)，更多的胞外Ca2+通過L型電壓通道流入到胞內(nèi)，使胞質(zhì)中Ca2+濃度增加。DAG和磷脂協(xié)同作用，并且在Ca2+的參與下，激活多種亞型的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)。在垂體 αT3-1細(xì)胞中，PKC活化是GnRH激活ERK途徑所必需的，但其作用機(jī)理還不清楚[25]。在垂體細(xì)胞中，Raf-1的作用是可活化ERK上游區(qū)。PKC可直接激活Raf-1，但是Raf-1在GnRH誘導(dǎo)ERK活性中的發(fā)揮作用尚不清楚。PKC激活后，使PKC途徑下游細(xì)胞MAPK及 ERK活性增加[2]。其中 MEK和 ERK的蛋白質(zhì)互作可以確定ERK信號(hào)作用的特異性[26]。ERK激活后可通過調(diào)節(jié)Egr-1基因的表達(dá)來促進(jìn) LHβ基因表達(dá)[27-28](圖2)。

圖2 胰島素影響GnRH活性的ERK途徑Fig.2 Ins affected GnRH activity through ERK pathway

ERK途徑包括轉(zhuǎn)導(dǎo)來自于大批不同細(xì)胞表面受體的信號(hào)途徑，這些受體中最典型的是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)。胰島素受體是RTKs亞科中的一員，因此可誘導(dǎo)ERK蛋白的激酶活性[21]。

胰島素受體在全身各處均被表達(dá)，包括腦垂體[29]。結(jié)合胰島素之后，胰島素受體的β亞基就會(huì)刺激酪氨酸發(fā)生自身磷酸化作用，導(dǎo)致受體酪氨酸激酶活性增加?；罨?，胰島素受體又使胞內(nèi)許多底物包括胰島素受體家族、GRB2相關(guān)結(jié)合 蛋 白 1(GRB2-associated-bindingprotein 1，Gab1)和Gαq/11磷酸化。這些底物磷酸化以后導(dǎo)致一些復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)，包括 PI3K和 ERK[30]。在促性腺激素釋放細(xì)胞系LβT2細(xì)胞中，胰島素受體是LβT2細(xì)胞的脂筏微結(jié)構(gòu)的基本成分，其作為膜蛋白對(duì)脂筏的選擇性親和力與GnRH受體的選擇性親和力一致[3]。并且在LβT2細(xì)胞系中，研究胰島素受體和GnRH受體(GnRHR)在促性腺細(xì)胞中的串聯(lián)作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)ERK是GnRH和胰島素信號(hào)所共用的靶目標(biāo)，二者共用會(huì)增加ERK的興奮性。胰島素單獨(dú)作用不能強(qiáng)烈激活ERK信號(hào)，但是ERK經(jīng)過GnRH磷酸化作用后，胰島素便有可能強(qiáng)烈激活ERK活性。并且二者之間的相互作用首先反映在由ERK活性定向調(diào)節(jié)控制的LHβ基因翻譯上，而且最終使LHβ基因翻譯活性增強(qiáng)[3]。因此，在垂體水平，胰島素可通過調(diào)節(jié)ERK活性間接促進(jìn)LH分泌。

2.3 胰島素通過NPY神經(jīng)元對(duì)GnRH活性的影響

神經(jīng)肽Y是1982年從豬腦中分離出的一種多肽，含36個(gè)氨基酸，是胰多肽家族中的一員，其廣泛分布在哺乳動(dòng)物的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中。位于下丘腦弓狀核上的NPY神經(jīng)元主要作用是刺激進(jìn)食，調(diào)節(jié)能量平衡。NPY神經(jīng)元在能量負(fù)平衡的條件下被激活，然后NPY釋放增加刺激室旁核及視前區(qū)的感受器，誘導(dǎo)攝食[31]。有證據(jù)表明，與調(diào)整能量代謝有關(guān)的神經(jīng)元能夠與GnRH神經(jīng)元相通，這些神經(jīng)元在體內(nèi)與下丘腦-垂體-性腺軸產(chǎn)生交互作用，即:在下丘腦內(nèi)側(cè)視前區(qū)，NPY纖維與GnRH神經(jīng)元的樹突和胞體密切相關(guān)，并且下丘腦正中隆起的NPY纖維可能也作用于GnRH的感受器[4]。因此，NPY神經(jīng)元被認(rèn)為是連接能量平衡與生殖及調(diào)節(jié)生殖軸活性的重要因子。當(dāng)NPY增加并刺激攝食時(shí)，GnRH的釋放及腦垂體、性腺的活性都會(huì)被抑制。支持這個(gè)假設(shè)的證據(jù)是:在NPY基因敲除的雌性小鼠中，禁食并不能引起LH分泌的抑制[32]。而且，缺乏 NPY的肥胖小鼠與正常肥胖小鼠相比，顯示出較好的繁殖力[33]。研究表明，母豬在泌乳期間，NPY對(duì)GnRH的抑制作用會(huì)增強(qiáng)，在背內(nèi)側(cè)下丘腦處起抑制作用的NPY增強(qiáng)子直接作用于GnRH細(xì)胞體，通過突觸后的NPY Y5受體去抑制GnRH神經(jīng)元活動(dòng)[34-35](圖3)。

圖3 NPY對(duì)GnRH的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of NPY on GnRH

但是，藥理學(xué)證據(jù)卻顯示，在NPY調(diào)節(jié)GnRH脈沖發(fā)生器時(shí)存在2種機(jī)制，一種是抑制，另一種是刺激[4]。在大多數(shù)物種中，雌二醇和孕酮水平較低時(shí)，例如在未到青春期或卵巢切除的動(dòng)物中，NPY對(duì)GnRH的水平、脈沖幅度和頻率是抑制的。但是在多數(shù)動(dòng)物中，類固醇水平升高后，就會(huì)將NPY的作用變?yōu)榇碳ぷ饔肹36]。并且，NPY的出現(xiàn)是GnRH激增所必需的。在動(dòng)物發(fā)情前期，如果NPY免疫中和或Y1受體封閉，LH峰就會(huì)衰減。敲除NPY基因的雌性顯示，其LH峰減少了70%。

在下丘腦弓狀核內(nèi)側(cè)區(qū)域既存在NPY基因的表達(dá)也存在胰島素受體的表達(dá)[4]。胰島素會(huì)抑制下丘腦NPY基因表達(dá)。在禁食動(dòng)物的腦室內(nèi)注射胰島素，結(jié)果弓狀核的NPY mRNA下降，同時(shí)下丘腦室旁核的 NPY下降[37]。泌乳大鼠去卵巢后NPY基因表達(dá)水平會(huì)比對(duì)照組高，但用胰島素處理48 h后，下丘腦弓狀核NPY mRNA表達(dá)水平降低[5]。研究表明，NPY基因表達(dá)受胰島素影響的同時(shí)，還受雌激素水平的調(diào)節(jié)。在下丘腦細(xì)胞系中，雌激素受體的比例(即ERα/ERβ)也調(diào)節(jié)NPY基因的表達(dá)，但是雌激素受體更偏向于抑制NPY基因。因此，在研究胰島素對(duì)NPY的影響時(shí)，也要考慮雌激素水平對(duì)NPY的調(diào)節(jié)。

3 胰島素調(diào)控GnRH在生產(chǎn)實(shí)踐中的意義

營養(yǎng)因素不僅可以對(duì)下丘腦GnRH及垂體促性腺激素分泌進(jìn)行直接調(diào)控，還能通過生長激素-胰島素樣生長因子-胰島素軸間接進(jìn)行調(diào)控。其中生長激素和胰島素樣生長因子的作用機(jī)制也是目前研究的熱點(diǎn)。繁殖內(nèi)分泌軸和代謝內(nèi)分泌軸之間有著復(fù)雜的相互作用和相互干擾，這些作用機(jī)制還不是十分清楚。將這些理論用于生產(chǎn)實(shí)踐中，對(duì)于遲遲不發(fā)情的后備母豬及斷奶母豬可以進(jìn)行催情補(bǔ)飼，飼喂碳水化合物特別是葡萄糖來促進(jìn)其發(fā)情。飼料能量來源主要是淀粉和脂肪，而葡萄糖作為第3種能量來源，卻很少被研究。大量研究通過調(diào)節(jié)淀粉和脂肪在飼料中添加的數(shù)量以及比例來縮短后備母豬初情期。如后備母豬以淀粉為主要能量與以脂肪為主要能量相比，能夠提高胰島素、胰島素樣生長因子、瘦素濃度和促進(jìn)LH分泌，提高后備母豬卵泡發(fā)育及提高排卵率[38]，提高初情靜立率，縮短發(fā)情周期[39]。

增加葡萄糖攝入可直接導(dǎo)致體內(nèi)胰島素水平增加，不僅對(duì)GnRH產(chǎn)生一系列影響，而且胰島素還促進(jìn)卵巢發(fā)育和提高優(yōu)勢卵泡的數(shù)量，這些都能提高母豬生產(chǎn)力[40]。如在后備母豬飼糧中每日添加60 g葡萄糖，在第2情期配種，配種日齡216日齡，體重123.5 kg，交配率92%，得到產(chǎn)活仔數(shù)10.76頭，窩產(chǎn)總重16.71 kg，斷奶總重60.03 kg的良好繁殖性能[41]。每日在斷奶母豬飼糧中添加150 g葡萄糖，可提高窩內(nèi)仔豬初生重均一度[42]。

研究表明，胰島素可能會(huì)保持和促進(jìn)排卵期之前卵巢上卵泡的發(fā)育能力，防止其退化和閉鎖，增加可能發(fā)育到排卵階段的卵泡數(shù)量。因此，研究主要以葡萄糖為飼料來源，增加動(dòng)物體內(nèi)胰島素水平與動(dòng)物發(fā)情之間的關(guān)系非常重要。利用多種營養(yǎng)調(diào)控手段來最終實(shí)現(xiàn)縮短母豬初情期和間情期，是未來研究飼料能量來源的重要課題。

4 小結(jié)

胰島素是動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)糖代謝的重要激素，代表著動(dòng)物體內(nèi)能量代謝水平。GnRH是動(dòng)物啟動(dòng)發(fā)情的起始因素，是調(diào)控動(dòng)物生殖的重要激素。隨著對(duì)胰島素和GnRH相互作用的深入研究，人們對(duì)機(jī)體能量平衡與生殖活動(dòng)之間的作用機(jī)制已經(jīng)有了較深的認(rèn)識(shí)。胰島素調(diào)節(jié)GnRH活性和功能過程中Egr-1、ERK和NPY均發(fā)揮重要作用，但是否還存在其他作用途徑有待于進(jìn)一步研究。全面理解能量平衡與動(dòng)物繁殖之間的復(fù)雜的作用關(guān)系，通過營養(yǎng)調(diào)控來調(diào)節(jié)胰島素的分泌，促進(jìn)動(dòng)物發(fā)情，是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物發(fā)情調(diào)控的有益探索。

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