外源纖維酶制劑對青貯玉米體外發(fā)酵特性以及甲烷生成的影響

陳 興 茅慧玲 王佳堃 吳晨暉 劉建新

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058)

粗纖維消化是一個涉及到多種酶參與的復(fù)雜水解過程[21-23]，反芻動物因?yàn)槿正g或者健康狀況有時不能提供足夠的酶。目前我國生產(chǎn)的酶制劑從純度到活力都有很大的改進(jìn)，木聚糖酶(xylanase，XYL)活力能達(dá)到40 000 U/g以上，內(nèi)切纖維素酶(cellulase，CEL)活力也能達(dá)到1 000 U/g左右。全面調(diào)查中國主要的纖維酶制劑產(chǎn)品，并參考國外的酶制劑，對比體外(瘤胃)發(fā)酵作用顯得非常必要。為此，本試驗(yàn)旨在通過對9種國產(chǎn)纖維酶制劑(5種木聚糖酶和4種纖維素酶)和2種美國公司提供的酶制劑(1種纖維素酶和1種木聚糖酶)進(jìn)行酶活比較測定，并用青貯玉米作為底物，評價其對體外發(fā)酵的影響，以期為酶制劑在反芻動物上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 纖維酶制劑以及蛋白質(zhì)濃度、酶活測定

11種纖維酶制劑包括5種纖維素酶(CEL-1、CEL-2、CEL-3、CEL-4、CEL-5)和 6 種木聚糖酶(XYL-1、XYL-2、XYL-3、XYL-4、XYL-5、XYL-6)。使用Super-Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(Cat.No.CW-0013)測定酶制劑的蛋白質(zhì)濃度，用多功能微孔板檢測系統(tǒng)(酶標(biāo)儀)(SpectraMax M-5，Molecular Devices)，在595 nm處檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品的蛋白質(zhì)濃度。在pH 6.6和溫度39℃下測定所有酶制劑的木聚糖酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活和外切葡聚糖酶活[24-27]。

1.2 底物以及體外試驗(yàn)設(shè)計

采用壓力讀取式體外產(chǎn)氣法(reading pressure technique，RPT)[28]，單因素試驗(yàn)設(shè)計;底物為青貯玉米，春玉米(8月15日收獲)帶穗青貯，貯存時間在4個月左右，65℃烘干后粉碎，樣品經(jīng)過0.45 mm篩過濾。干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量分別為 96.0%、8.13%、59.2%和41.2%。稱取0.5 g(DM)的青貯玉米于120 mL的產(chǎn)氣瓶中，將酶制劑溶解后，在4℃下20 000×g離心10 min，取上清液加入到底物中。纖維素酶的添加水平為30 U/g底物(DM)，木聚糖酶的添加水平為40 U/g底物(DM)。酶和底物在室溫下充分反應(yīng)3 h[7]后，加入40 mL的厭氧人工瘤胃緩沖液，39℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱放置21 h，每個處理6個重復(fù)。

晨飼前，抽取3頭瘺管奶牛的瘤胃液，混合后4層紗布過濾，在每個產(chǎn)氣瓶接種10 mL的瘤胃液，置于(39.0±0.5)℃的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)測定指標(biāo)

產(chǎn)氣量:在培養(yǎng) 3、6、9、12、24、48 h 時用壓力傳感器讀取產(chǎn)氣瓶的氣體壓力，將壓力轉(zhuǎn)換成產(chǎn)氣量。利用各培養(yǎng)時間點(diǎn)(t，h)累計產(chǎn)氣量(P，mL)，按下式計算產(chǎn)氣參數(shù):P=a+b(1-e-ct)[式中:P為培養(yǎng)t h的累計產(chǎn)氣量(mL)，a為目標(biāo)成分的快速降解部分的產(chǎn)氣量(mL)，b為目標(biāo)成分的慢速降解部分的產(chǎn)氣量(mL);c為b部分的降解速率(mL/h)]。

甲烷產(chǎn)量:在培養(yǎng)6、12、24 h時，吸取1 mL 氣體樣品，用氣相色譜儀(GC-2010，Shimadzu)分析氣體的甲烷含量。

揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)產(chǎn)量:終止培養(yǎng)后，取上清液1 mL，混合 0.2 mL的8.2%偏磷酸，在4℃下20 000×g離心10 min，用氣相色譜儀(GC-2010，Shimadzu)分析乙酸、丙酸、丁酸以及總VFA產(chǎn)量。

DM、NDF、ADF降解率:培養(yǎng)底物經(jīng)稱重后過300目尼龍袋，清水洗滌至無色，65℃烘干48 h，測定殘渣的 DM、NDF、ADF 含量[29]，計算目標(biāo)降解率。

我早就估計到西山是要出事的，三十多輛蹦子三輪車成天在井下穿梭來往，車與車擦碰得火星四濺。不過西山是低硫礦，毒瓦斯的比例不到十萬分之一。西山“固若金湯”。這是那個肥胖的煤老板早就向我們拍著胸脯子說的話。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件處理，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，各平均值之間用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)濃度和酶活測定

在pH 6.6和溫度39℃下的試驗(yàn)所用酶的木聚糖酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活和外切葡聚糖酶活被重新測定，結(jié)果表明各廠家所提供的酶制劑酶活差異很大，酶的蛋白質(zhì)濃度也有較大的差異(表 1)。

表1 試驗(yàn)所用11種外源纖維酶制劑的木聚糖酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活和外切葡聚糖酶活Table1 Activities of xylanase，endoglucanase and exoglucanase in 11 kinds of exogenous fibrolytic enzymes used in this study

2.2 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)

與對照組相比，纖維素酶組的48 h產(chǎn)氣量有降低趨勢(表2)，其中 CEL-1、CEL-2、CEL-5組達(dá)到了顯著水平(P＜0.05);潛在產(chǎn)氣量(a+b)均顯著下降(P＜0.05)，其中CEL-1、CEL-2組下降程度最大，潛在產(chǎn)氣量分別下降了25.3%和21.3%;但是，產(chǎn)氣速率(c)均顯著加快(P＜0.05)，添加CEL-1時可提高產(chǎn)氣速率達(dá)82.5%。除XYL-3組潛在產(chǎn)氣量顯著低于對照組(P＜0.05)外，木聚糖酶組其他產(chǎn)氣參數(shù)均與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

除XYL-4對ADF降解率效果不顯著(P＞0.05)外，其他酶制劑均顯著提高了青貯玉米DM、NDF、ADF的降解率(P ＜0.05)，其中 CEL-2組的DM、NDF和ADF降解率分別達(dá)到65.4%、60.4%和61.0%，分別比對照提高了17.6%、21.5%、19.8%。

2.3 VFA和甲烷產(chǎn)量

與對照組相比，XYL-1、XYL-4和CEL-5的添加顯著提高了總VFA產(chǎn)量(P＜0.05，表3)，但其他酶制劑對總VFA產(chǎn)量均無顯著影響(P＞0.05)。添加XYL-3和XYL-4均顯著降低了乙酸摩爾比和乙酸∶丙酸(P＜0.05)，顯著提高了丙酸摩爾比(P＜0.05)，但僅XYL-4顯著提高了丁酸摩爾比(P＜0.05)，其他酶制劑對各種脂肪酸比例的影響均不顯著(P＞0.05)?？傮w而言，酶制劑對各種脂肪酸的比例影響不大。

由表4可知，酶制劑對甲烷產(chǎn)量的影響呈現(xiàn)了較大的變化，在培養(yǎng)6 h時，添加XYL-5、XYL-6顯著降低了甲烷產(chǎn)量(P＜0.05)，而添加CEL-1、CEL-2則顯著增加了甲烷產(chǎn)量(P＜0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，到12 h時，僅添加CEL-1顯著影響了甲烷產(chǎn)量(P＜0.05)，而到24 h時，酶制劑對甲烷生成的影響變得不再顯著(P＞0.05)。

3 討論

市面上的酶制劑除了用于飼料添加劑外，有些是設(shè)計用于果汁生產(chǎn)、造紙、染料和一些化學(xué)工業(yè)的[6]，而應(yīng)用在不同動物上的酶制劑的最適條件也有較大差異，如國外公司提供的纖維素酶活和木聚糖酶活是在pH 4.8、50℃下測得的，而反芻動物瘤胃環(huán)境是pH 6.6和39℃，所以我們測得的酶活比公司提供的酶活略低。在不同的溫度和條件下，纖維素酶活和木聚糖酶活有很大的變化[23]。因此在利用酶制劑作為動物添加劑時，有 必要根據(jù)動物消化道的環(huán)境條件來測定酶活。

表2 添加11種外源纖維酶制劑對以青貯玉米為底物體外培養(yǎng)試驗(yàn)產(chǎn)氣參數(shù)以及DM、NDF、ADF降解率的影響Table2 Effects of 11 kinds of exogenous fibrolytic enzymes on gas production parameters and the degradation rates of DM，NDF and ADF in the in vitro test of corn silage as a substrate(n=3)

表3 添加11種外源外源纖維酶制劑對青貯玉米為底物體外培養(yǎng)試驗(yàn)48 h總VFA及單個VFA產(chǎn)量的影響Table3 Effects of 11 kinds of exogenous fibrolytic enzymes on total and individual VFA yields at 48 h in the in vitro test of corn silage as a substrate(n=3)

表4 添加11種外源纖維酶制劑對青貯玉米為底物體外培養(yǎng)試驗(yàn)在6、12、24 h時甲烷累計產(chǎn)量的影響Table4 Effects of 11 kinds of exogenous fibrolytic enzymes on cumulative methane production at 6，12 and 24 h in the in vitro test of corn silage as a substrate(n=3) mL/g

有試驗(yàn)表明，外源酶制劑添加水平在0.5～1.5 mg/g底物(DM)的時候，添加效果最好[7，9-11，24，30]。根據(jù)我們所測得的木聚糖酶活折算，1.5 mg/g的添加水平酶活大約在40 U/g，纖維素酶則根據(jù)國外酶制劑公司的推薦值以及之前的試驗(yàn)所報道的用量[31]，即30 U/g的水平添加。

之前的體外試驗(yàn)證明，纖維酶制劑可以提高苜蓿干草以及青貯玉米的產(chǎn)氣量以及DM、NDF降解率[7，10-11，32]，但也有試驗(yàn)表明添加酶制劑沒有作用，產(chǎn)氣量變化也不大[33]，Giraldo 等[13]利用熱帶地區(qū)干草為底物開展產(chǎn)氣試驗(yàn)，結(jié)果表明木聚糖酶對產(chǎn)氣參數(shù)沒有任何作用。Beauchemin等[6]曾討論過試驗(yàn)結(jié)果缺乏一致性的原因，指出要獲得較好的效果，酶與底物的匹配是一個重要的前提，而不僅僅只考慮到酶活大小。Colombatto等[24]在2003年測量了23種酶制劑的蛋白質(zhì)濃度和17種酶活指標(biāo)，以及酶對青貯玉米和苜蓿干草降解的還原糖產(chǎn)量，對還原糖產(chǎn)量和和酶活指標(biāo)的回歸分析顯示，酶的蛋白質(zhì)濃度能解釋60%左右的還原糖變化，但是酶活只能解釋1/3的體外DM降解率。Eun等[10]用2種不同的手段證明了影響苜蓿干草和青貯玉米這2種底物的體外產(chǎn)氣參數(shù)的主要酶是外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶。因?yàn)榍噘A玉米中半纖維素含量較少，所以木聚糖酶對青貯玉米的作用較小不難理解，在本試驗(yàn)中，木聚糖酶一方面對產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率沒有顯著影響，另一方面卻提高了DM、NDF以及ADF降解率，可能的原因是木聚糖酶降解了部分DM生成五碳糖，但是五碳糖在微生物體內(nèi)利用率要顯著低于六碳糖[34]，這一推測有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

近期的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，添加酶制劑可降低乙 酸 ∶丙 酸[10，32-33，35]。Tirado-Estrada 等[36]在2011年給以玉米干草為基礎(chǔ)飼糧的40只羊羔[(20±1.6)kg]的飼糧中添加酶制劑，持續(xù)飼喂55 d后，2種酶均顯著提高了總VFA產(chǎn)量，其中纖維素酶顯著提高了丙酸百分比，顯著降低了丁酸百分比，而且使得乙酸∶丙酸顯著下降。酶制劑提高發(fā)酵VFA的產(chǎn)量的原因可能在于改變了瘤胃微生物數(shù)量和區(qū)系，Chung等[14]利用9頭安裝瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛，根據(jù)3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計，添加低水平和高水平的酶制劑，在第15天和第19天采集瘤胃內(nèi)容物后，利用特異性16S-rRNA分析顯示，高水平的酶制劑處理中嗜淀粉瘤胃桿菌數(shù)量顯著上升，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量有上升趨勢，反芻月形單胞菌的數(shù)量隨著酶制劑添加水平的增加呈線性遞增，低水平的酶處理中牛鏈球菌數(shù)量趨于降低[14]。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃內(nèi)主要的纖維素降解菌，反芻月形單胞菌具有琥珀酸脫羧基作用，而反芻動物主要靠微生物的琥珀酸脫羧作用獲得丙酸。因此，丙酸比例上升有可能是因?yàn)榉雌c月形單孢菌數(shù)量的上升所導(dǎo)致。此外，考慮到瘤胃原蟲也是影響纖維降解的重要因素，所以需要進(jìn)一步研究酶制劑對原蟲的影響。

本試驗(yàn)中，在培養(yǎng)6和12 h時，酶制劑對甲烷生成呈現(xiàn)不同的變異性，在24 h時的甲烷生成似乎不再受到酶制劑的影響(表4)。Beauchemin等[19-20]提到添加酶制劑一方面會增加甲烷的絕對產(chǎn)量，另一方面有可能會降低每千克DM或者生產(chǎn)每千克牛奶所生成的甲烷量。但是Chung等[14]的動物試驗(yàn)表明，按全混合日糧DM 的0.5或1.0 mL/kg添加酶制劑，無論是每千克飼料DM的甲烷排放量還是每千克牛奶所排放的甲烷量都有顯著上升;Zhou等[37]利用實(shí)時定量PCR技術(shù)分析產(chǎn)奶牛瘤胃內(nèi)甲烷菌區(qū)系發(fā)現(xiàn)，加入酶制劑可改變甲烷菌區(qū)系，同時增加甲烷產(chǎn)量。本試驗(yàn)中，XYL-5、XYL-6在培養(yǎng)6 h時降低了甲烷生成;但是隨著發(fā)酵時間延長，甲烷生成逐漸升高的原因還并不很清楚，可能是酶制劑通過改變瘤胃內(nèi)部微生物數(shù)量和比例來提高瘤胃內(nèi)飼料的利用率，同時也增加甲烷產(chǎn)量。酶制劑的效果還需要通過更為長期的動物試驗(yàn)來驗(yàn)證。

4 結(jié)論

①體外試驗(yàn)表明，添加外源酶制劑可提高青貯玉米的DM、NDF、ADF的降解率，其中添加纖維素酶顯著提高了青貯玉米的產(chǎn)氣速率，顯著降低了潛在產(chǎn)氣量，但是木聚糖酶對產(chǎn)氣參數(shù)影響不顯著。

②在培養(yǎng)前期，添加不同的酶制劑對甲烷生成的影響存在差異性，培養(yǎng)后期無顯著影響。

致謝:

本試驗(yàn)在浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所完成，感謝浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所的全體師生對此試驗(yàn)的支持以及提出的寶貴意見。試驗(yàn)所用的酶制劑由4家酶制劑生產(chǎn)企業(yè)提供，在此一并向他們致謝。

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