飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚生長性能、體組成及血清生化指標(biāo)的影響

姜柯君 王際英 張利民 柳旭東 張德瑞 孫永智

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306;2.山東省海洋水產(chǎn)研究所，煙臺 264006)

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖模式趨于集約化。隨著養(yǎng)殖密度的加大，抗生素和漁用藥物的不合理使用、水產(chǎn)品藥殘和環(huán)境污染等問題日益突出。從營養(yǎng)學(xué)角度入手，選擇安全、健康、無污染的飼料添加劑可在一定程度上促進水產(chǎn)動物對飼料的消化利用，提高其生長性能及抗病力。近年來，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在動物消化道蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中，有很大一部分為小肽(一般含2～3個氨基酸殘基)，它們以完整形式直接被機體吸收利用[1-3]，在蛋白質(zhì)消化、吸收和代謝中起重要作用[4-5]。大量研究證實，小肽具有促生長、誘食、促進脂肪代謝、增強機體免疫及抗氧化能力等作用[6-16]。

星斑川鰈(Platichthys stellatus，Pallas 1788)又稱星突江鰈，隸屬鰈形目(Pleuronectiformes)鰈科(Pleuronectidae)鰈亞科(Pleuronectinae)川鰈屬(Platichthys)，俗稱珍珠鰈、沼鰈等。星斑川鰈是底棲海水魚類，其性情溫順、廣溫廣鹽[17]，適宜集約化養(yǎng)殖;同時，其肉味鮮美、口感好、富含膠原蛋白，而且冷藏后肉質(zhì)基本不變，是一種極具商業(yè)開發(fā)價值的海水魚類。然而，有關(guān)星斑川鰈飼料添加劑的研究報道較少，其中小肽對星斑川鰈的影響尚未見報道。本試驗以星斑川鰈幼魚作為試驗動物，旨在探究飼料中添加不同水平的小肽對其生長性能、體組成及血清生化指標(biāo)的影響，為星斑川鰈配合飼料的基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用小肽購自美國華達生物科技有限公司，該小肽以鱈魚為原料，采用復(fù)合酶系的酶解反應(yīng)，經(jīng)固液分離、篩選提純、冷凍干燥等工藝生產(chǎn)所得。產(chǎn)品為淺棕色粉末狀固體，基本營養(yǎng)成分為:粗蛋白質(zhì) 48.00%，粗脂肪 10.32%，灰分19.84%，水分8.60%。參照文獻[12]的方法，利用高效液相色譜儀(安捷倫1200系列)，配備TSKGel G2000 SWXL柱，通過高效凝膠過濾色譜法測定小肽分子質(zhì)量，其中2～3肽(200～500 u)含量為40.51%，小肽分子質(zhì)量分布見表1。

表1 小肽分子質(zhì)量分布Table1 Molecular mass distribution in small peptides %

1.2 試驗飼料

以魚粉、酪蛋白、大豆?jié)饪s蛋白等為主要蛋白質(zhì)源，魚油為脂肪源，分別添加0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.50%的小肽，制成6種試驗用配合飼料，并分別編號為 S0、S1、S2、S3、S4、S5。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗用星斑川鰈幼魚購自榮成港西水產(chǎn)養(yǎng)殖場，馴養(yǎng)2周后進行分組。選取規(guī)格均勻、體健無傷、平均體重為(15.30±0.03)g的幼魚540尾，隨機分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚，以重復(fù)為單位放養(yǎng)于全封閉循環(huán)養(yǎng)殖桶內(nèi)。正式試驗開始后各組隨機飼喂1種試驗飼料，以飼喂未添加小肽的試驗飼料的組為對照組。

養(yǎng)殖試驗在微流水環(huán)境中進行，保證溶氧＞5 mg/L，控制水溫在17～19℃，pH 7.8～8.2，鹽度28～30，亞硝酸氮、氨氮均小于0.1 mg/L。每天08:00和16:00定時飽食投喂，根據(jù)魚體重、攝食情況及時調(diào)整投喂量，同時記錄投喂量。投喂30 min后，將殘餌吸出，計算殘餌重。飼養(yǎng)期為8周。

1.4 樣品采集和分析

生長試驗結(jié)束后，對試驗魚饑餓24 h，每桶整體稱重后，隨機取18尾魚，其中3尾作為全魚常規(guī)營養(yǎng)成分分析樣品，其余的稱體重、測體長后尾靜脈采血。血液于4℃靜置，4 000 r/min離心10 min，取上清液，儲存于-70℃，用于血清生化指標(biāo)(代謝、免疫和抗氧化指標(biāo))的測定。采血后的魚分離背肌用于常規(guī)營養(yǎng)成分分析。

生長指標(biāo)計算公式如下:

飼料、全魚和背肌中的水分含量采用105℃恒重法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，灰分含量采用馬福爐550℃灼燒法測定。血清中總膽固醇(total cholesterol，TCHO)和甘油三酯 (triacyglycerol，TG)含量采用日立全自動生化分析儀(7020型，Hitachi)測定，血清丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLB)含量以及溶菌酶(lysozyme，LSZ)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

表2 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table2 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.5 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用Duncan氏法進行多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚生長性能的影響

由表3可知，隨著小肽添加量的提高，星斑川鰈幼魚的增重率先上升后下降，在1.00%添加組達到最高，除0.25%添加組外，各添加組均顯著高于對照組(P＜0.05);攝食率也呈現(xiàn)相似的趨勢，0.75%和1.00%添加組顯著高于對照組(P＜0.05);各添加組的末體重和蛋白質(zhì)效率均高于對照組，其中0.75%和1.00%添加組的末體重顯著高于對照組(P＜0.05)，0.05%、0.75%、1.00%和1.50%添加組的蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組(P＜0.05);特定生長率以1.00%添加組為最高，除0.25%添加組外，各添加組均顯著高于對照組(P＜0.05);與對照組相比，各添加組的飼料系數(shù)均顯著降低(P＜0.05)。以增重率為指標(biāo)，得到增重率和小肽添加量之間的回歸關(guān)系，如圖1所示，回歸方程為:Y=-55.003X2+101.93X+95.235(R2=0.971 8)，經(jīng)計算，飼料中小肽的最適添加量為0.93%。

表3 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚生長性能的影響Table3 Effects of small peptides supplementation on growth performance of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

圖1 小肽添加量與增重率的回歸關(guān)系Fig.1 Regression relationship between small peptidessupplemental level and WGR

2.2 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚體組成的影響

由表4可知，全魚的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和灰分含量各組之間均無顯著差異(P＞0.05)。隨著小肽添加量的提高，背肌粗脂肪含量先下降后上升，以0.75%添加組為最低，除0.25%添加組外，其他各添加組均顯著低于對照組(P＜0.05);1.00%和1.50%添加組的背肌粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組(P＜0.05);背肌水分和灰分含量各組之間無顯著差異(P＞0.05)。

表4 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚體組成的影響Table4 Effects of small peptides supplementation on body composition of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

2.3 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，對于脂肪代謝指標(biāo)，各添加組的血清總膽固醇含量均低于對照組，且0.50%添加組降低顯著(P＜0.05);與對照組相比，各添加組的血清甘油三酯含量均顯著降低(P＜0.05)，各添加組之間無顯著差異(P＞0.05)。對于蛋白質(zhì)代謝指標(biāo)，1.00%添加組的血清總蛋白含量顯著高于對照組(P＜0.05);血清球蛋白含量隨小肽添加量的提高先升高后降低，除1.50%添加組外，各添加組均顯著高于對照組(P＜0.05);血清白蛋白含量各組之間無顯著差異(P＞0.05)。

由表6可知，各添加組的血清溶菌酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中以1.00%添加組為最高;1.00%添加組的血清過氧化氫酶活性顯著高于對照組(P＜0.05)，血清丙二醛含量顯著低于對照組(P＜0.05)。

表5 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚血清脂肪和蛋白質(zhì)代謝指標(biāo)的影響Table5 Effects of small peptides supplementation on metabolism indices of lipid and protein in serum of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

表6 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響Table6 Effects of small peptides supplementation on serum immune and antioxidant indices of juvenile starry flounder(Platichthys stellatus)

3 討論

3.1 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚生長性能的影響

本試驗結(jié)果顯示，星斑川鰈幼魚生長性能受到小肽添加量的影響顯著，其中增重率和特定生長率隨添加量的提高呈先上升后下降的變化，飼料系數(shù)顯著降低，蛋白質(zhì)效率顯著提高，表明添加適量小肽能促進星斑川鰈幼魚生長，提高飼料利用率和蛋白質(zhì)利用率，與前人研究結(jié)果[6-11，13]類似，Yu 等[6]、Erba 等[7]、薛敏等[8]、McLean 等[9]、Zambonino 等[10]、Leonard 等[11]和 Refstie 等[13]均發(fā)現(xiàn)飼料中添加小肽有明顯的促生長作用。同樣，于輝等[15]在草魚(Ctenopharyngodon idella)飼料中添加酪蛋白小肽，試驗組草魚的相對生長率、蛋白保留效率、飼料利用率均較對照組表現(xiàn)得好。Kotzamanis等[12]在飼料中添加10%的商品小肽，歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)表現(xiàn)出良好的生長性能，而本試驗在小肽添加量為1.00%時星斑川鰈幼魚已表現(xiàn)出較好的生長性能，出現(xiàn)上述差異的原因可能與小肽構(gòu)成成分有關(guān)。目前來看，小肽促進星斑川鰈幼魚生長的原因可能有以下3點:第一，小肽作為蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，能被機體直接吸收利用[1-3，9，18]，加快蛋白質(zhì)的吸收，從而減少機體分解蛋白質(zhì)耗能，節(jié)約能量用于生長[3];第二，小肽具有吸收速度快、耗能低、載體不易飽和等吸收特點[19]，可提高氨基酸的吸收速度，從而提高魚體對飼料中蛋白質(zhì)的利用率;第三，多種生物活性小肽可在消化道中釋放出來，促進腸道蠕動，改善消化機能，促進動物的生長[20]。本試驗中，小肽添加量為0.75% ～1.00%時，星斑川鰈幼魚生長性能表現(xiàn)最好，過多添加對其生長未產(chǎn)生促進作用，與 Erba 等[7]、Zambonino 等[10]報道 一 致。Cahu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，用含小肽的商品魚粉水解物替代25%的魚粉時，促進了海鱸(Dicentrarchus labrax)幼魚的生長，但當(dāng)替代50%和75%的魚粉時，對生長卻有抑制作用。Kotzamanis等[12]用含小肽的商品魚粉水解物替代10%的魚粉時，顯著促進了歐洲鱸魚的生長，但當(dāng)替代19%的魚粉時，則對生長有抑制作用。Zambonino等[10]研究發(fā)現(xiàn)飼料中高水平的小肽會顯著影響胰島素的合成和分泌，從而抑制魚體生長。過量添加小肽未促進魚體生長，可能存在2個方面的原因:一方面是高水平的小肽致使肽轉(zhuǎn)運機制飽和;另一方面是低分子質(zhì)量肽的快速水解，產(chǎn)生過多的氨基酸，使腸道的氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)飽和[12，14]。

本試驗中，飼料中添加小肽后，星斑川鰈幼魚的攝食率升高，在添加量達到0.75%后甚至達到顯著水平，表明小肽具有一定的促進攝食的功效，與 Refstie等[13]和 Cahu 等[14]的結(jié)論一致。小肽促進攝食的原因可能是在小肽水解過程中產(chǎn)生了一些具有生物活性的肽[12]，部分肽具有誘食作用。

3.2 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚體組成的影響

星斑川鰈幼魚全魚和背肌的常規(guī)成分分析中，水分、灰分含量無顯著性差異，粗脂肪含量以對照組最高，這與于輝等[15]的研究結(jié)果相似。引起此現(xiàn)象的可能原因有2點:一是添加小肽后提高了機體蛋白質(zhì)的合成，降低了游離氨基酸轉(zhuǎn)化為脂肪在魚體中的沉積[21];二是小肽能阻礙脂肪的吸收，并能促進脂質(zhì)代謝[22]，其進一步的機理有待研究。此外，背肌粗蛋白質(zhì)含量在小肽添加量為1.00%和1.50%時顯著高于對照組。這可能是因為小肽與游離氨基酸具有相互獨立的吸收機制[23]，可減輕由于游離氨基酸相互競爭吸收位點而產(chǎn)生的拮抗作用;而且小肽吸收速度快，吸收峰高，能快速提高動靜脈的氨基酸差值，提高整體蛋白質(zhì)合成[24]。同時，小肽獨特的吸收機制使其中的氨基酸吸收速度大于游離氨基酸，從而提高試驗魚對蛋白質(zhì)的利用[25]。

3.3 飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚血清生化指標(biāo)的影響

膽固醇和甘油三酯的含量反映了動物體內(nèi)的脂肪沉積情況[5]。本試驗中，各添加組總膽固醇和甘油三酯的含量均低于對照組。分析其原因可能是小肽的添加加速了脂類的代謝，降低了血清中脂肪的含量[22，26]。血清總蛋白是機體蛋白質(zhì)代謝水平的重要參考指標(biāo)之一，可以用來衡量蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率[16，27]，主要分為白蛋白和球蛋白，白蛋白作為營養(yǎng)物質(zhì)載體，維持血液滲透壓[16，28]，球蛋白來源于漿細胞的分泌，反映機體的抵抗力[28]。研究指出，添加小肽會提高血液中球蛋白的數(shù)目，球蛋白可以激活體內(nèi)的白細胞，發(fā)揮免疫作用[16]。本試驗中血清總蛋白和球蛋白含量隨小肽添加量的提高呈先升高后降低的趨勢，表明適量小肽的添加能在一定程度上促進血清蛋白質(zhì)的合成，提高機體球蛋白含量，進而提高機體的免疫力。

魚類的免疫系統(tǒng)不夠完善，溶菌酶作為魚類非特異性免疫的重要組成成分，在魚體的防御機制中起著重要作用[26]。溶菌酶不僅能水解細菌細胞壁而致細菌死亡，還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌[29]，在一定程度上，溶菌酶與免疫球蛋白、白細胞在功能上呈正相關(guān)[30-34]。本試驗中，飼料中添加小肽后血清溶菌酶活性升高，進而可能誘導(dǎo)其他免疫因子[29，35]，共同參與機體免疫，提高機體免疫力。小肽提高免疫的另一個原因可能是小肽的水解過程中產(chǎn)生了免疫刺激肽和抗菌肽等免疫活性肽[36]，這些活性肽參與魚體內(nèi)的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，提高魚體的免疫力。

自由基具有極強的氧化還原能力，過多存在會造成動物組織氧化損傷，所以機體必須具備一套有效的抗氧化防御機制來調(diào)節(jié)自由基的平衡[37]。過氧化氫酶是機體清除氧自由基的重要的酶系[38]，丙二醛是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[39]。這2個指標(biāo)能有效地體現(xiàn)機體的抗氧化能力。本試驗中，隨著小肽添加量的提高，血清過氧化氫酶活性先上升后下降，血清丙二醛含量則先下降后上升，表明適量添加小肽能有效增強酶促反應(yīng)防御系統(tǒng)中各種酶的活性，清除體內(nèi)過多的活性自由基，增強機體抗氧化能力，減少機體脂質(zhì)過氧化，從而增強機體免疫能力。過多添加小肽并未提高機體的抗氧化能力，分析其原因可能是過量小肽的促脂質(zhì)過氧化作用的結(jié)果[39]。

4 結(jié)論

①飼料中添加小肽影響星斑川鰈幼魚的生長性能，根據(jù)增重率得出的最適添加量是0.93%。

②飼料中添加小肽影響星斑川鰈幼魚的免疫和抗氧化能力，其最適添加量是1.00%。

③在本試驗條件下，綜合考慮增重率以及免疫和抗氧化指標(biāo)，得出最適宜的小肽添加量為0.93% ～1.00%。

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