生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ對(duì)奶牛乳蛋白合成關(guān)鍵激酶及調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)量的影響

季 昀 龐學(xué)燕 田 青 王夢(mèng)芝 王洪榮* 敖長(zhǎng)金

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)是一種由動(dòng)物垂體前葉合成分泌的肽類激素。在動(dòng)物體內(nèi)，GH通過與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)脂肪分解、蛋白質(zhì)合成以及肝臟糖異生作用，還具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫等多種生理學(xué)功能。早期的大量研究證實(shí)了GH具有明顯的促乳作用，能夠提高奶牛泌乳量、乳成分產(chǎn)量和飼料轉(zhuǎn)化效率[1-6]。這一方面得益于GH在體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)分配功能[7-8]，促使更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配到乳腺;另一方面歸因于其促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育，提高腺泡活性，維持泌乳持久性的作用[9]。GH能夠刺激肝臟合成分泌大量的胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(insulin-like growth factor-I，IGF-Ⅰ)[10-11]，而研究發(fā)現(xiàn)奶牛血液IGF-Ⅰ含量通常與泌乳量呈正相關(guān)[12]，另外，前人證實(shí)了奶牛乳腺組織上存在生長(zhǎng)激素受體(GHR)[13]和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ受體(IGF-ⅠR)[14]，因此 GH可能是直接作用于乳腺上的GHR或通過刺激IGF-Ⅰ的合成間接作用于乳腺來發(fā)揮作用的[15]，深入研究GH和IGF-Ⅰ對(duì)奶牛乳腺的作用機(jī)理對(duì)奶業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。GH能夠提高奶牛乳蛋白和酪蛋白產(chǎn)量[7，16]，而這種產(chǎn)量的提高可能也與血液中IGF-Ⅰ濃度的升高有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)陰外動(dòng)脈灌注IGF-Ⅰ能明顯促進(jìn)乳汁分泌，提高乳腺血流量[17-18]。在組織細(xì)胞水平上，利用奶牛乳腺組織或乳腺上皮細(xì)胞為模型的相關(guān)研究已報(bào)道了GH能夠促進(jìn)αs-酪蛋白的合成[19]和 β - 酪蛋白基因的表達(dá)[20]，IGF-Ⅰ能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成[21]，但它們調(diào)控乳蛋白合成的機(jī)理還未完全闡明，前人的研究表明乳蛋白合成在轉(zhuǎn)錄水平受到Janus激酶2-轉(zhuǎn)錄激活子5(JAK2-STAT5)信號(hào)通路調(diào)節(jié)[22]，在翻譯水平主要受到mTOR信號(hào)通路調(diào)控[23]，而 GH和IGF-Ⅰ對(duì)這些信號(hào)通路上與調(diào)控乳蛋白合成有關(guān)的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)量是否有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道較少見，因此本試驗(yàn)以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究材料，首先用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)法在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中檢測(cè)是否有GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)，確定胞外GH和IGF-Ⅰ是否直接作用于受體來發(fā)揮作用;然后測(cè)定 GH和 IGF-Ⅰ對(duì)κ-酪蛋白(CSN3)mRNA表達(dá)量的影響;最后在前人的研究基礎(chǔ)上，選擇在胞內(nèi)與乳蛋白合成調(diào)控相關(guān)的一些重要的激酶和調(diào)節(jié)因子，探究GH和IGF-Ⅰ對(duì)這些基因mRNA表達(dá)量的影響，旨在為GH和IGF-Ⅰ調(diào)控乳蛋白合成的機(jī)理奠定一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器

電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)、倒置顯微鏡(CKX41，Olympus)、超低溫冰箱(美國(guó) Thermo)、冷凍離心機(jī)(5415R型，德國(guó)Eppendorf)、常溫低速離心機(jī)(上海盧湘儀)、PCR儀(ABI 2720型)、NanoDrop ND-1000濃度測(cè)定儀(美國(guó)Thermo)、RT-qPCR儀(ABI 7500型)、普通PCR儀(ABI 2720型)、凝膠成像系統(tǒng)(Infinity 3026型，法國(guó)Vilber)等。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)、胎牛血清(美國(guó)Gibco)、碳酸氫鈉(美國(guó)Sigma)、青鏈霉素(美國(guó)Gibco)、兩性霉素B(美國(guó)Amresco)、表皮生長(zhǎng)因子(美國(guó)Gibco)、催乳素(美國(guó)Sigma)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(美國(guó)Gibco)、皮質(zhì)醇(美國(guó)Sigma)、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó) Thermo)、重組牛 GH(美國(guó)RayBiotech)、重 組 IGF-Ⅰ (美 國(guó) Peprotech)、RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)、PrimeScripRT Master Mix(日本 TaKa-Ra)、SYBPremix Ex TaqTMⅡ(日本 TaKaRa)、Takara TaqTM試劑盒(日本TaKaRa)等。

1.1.3 細(xì)胞來源

乳腺組織來自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)提供的泌乳中后期健康中國(guó)荷斯坦奶牛，運(yùn)用手術(shù)法活體采集5 g左右乳腺組織進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)采用膠原酶消化法進(jìn)行，傳代及純化過程中用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)除去成纖維細(xì)胞。得到的純?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞用凍存液于-70℃凍存待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清，并補(bǔ)充100 U/mL青鏈霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B、1 μg/mL催乳素、1 μg/mL 胰島素 -轉(zhuǎn)鐵蛋白 -硒、500 ng/mL氫化可的松以及10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子)，按照5×104個(gè)/mL的密度接種到6孔板中，每孔2 mL。24 h細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌各孔2次，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基處理細(xì)胞16 h，再用PBS洗滌各孔2次，然后按照如下方案對(duì)細(xì)胞處理24 h:對(duì)照組采用無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基;GH組采用無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基+GH(100 ng/mL);IGF-Ⅰ組采用無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基+IGF-Ⅰ(100 ng/mL);GH+IGF-Ⅰ組采用無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基 +GH(100 ng/mL)+IGF-Ⅰ(100 ng/mL)]，每孔加2 mL培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每孔為1個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞總RNA的提取

細(xì)胞處理完成后，總RNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行。用NanoDrop ND-1000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取的總RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定其完整性?？俁NA于-70℃保存，待反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

1.3.3 PCR檢測(cè)GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)

PCR反應(yīng)使用Takara TaqTM試劑盒于普通PCR儀上進(jìn)行。按照試劑盒說明配制反應(yīng)液:TaKaRa Taq(5 U/μL)0.25 μL、10 × PCR 緩沖液(含 Mg2+)5 μL、dNTP 4 μL、模板 cDNA 250 ng、上游和下游引物(20 μmol/L)各 1 μL;加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 5 min;94℃50 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。PCR反應(yīng)中引物序列見表1。GHR引物參照文獻(xiàn)[24]，IGF-ⅠR引物采用 Primer 3引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察結(jié)果。

表1 GHR和IGF-ⅠR基因引物序列Table1 Sequences of primers for GHR and IGF-ⅠR genes

1.3.4 RT-qPCR法測(cè)定mRNA表達(dá)量

通過熔解曲線和1%瓊脂糖凝膠電泳判定PCR反應(yīng)的特異性。

以GAPDH為內(nèi)參基因計(jì)算各基因的mRNA表達(dá)量，計(jì)算公式[26]為:

式中:E目的基因和 E內(nèi)參基因分別為該基因的 PCR擴(kuò)增效率;Ct為閾值循環(huán)。PCR擴(kuò)增效率通過LinReg PCR 11.0 軟件計(jì)算[27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SAS 9.1軟件ANOVA程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)蘇后奶牛乳腺上皮細(xì)胞貼壁與增殖情況

復(fù)蘇后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中經(jīng)過24 h大部分已貼壁(圖1)，細(xì)胞成活率達(dá)90%以上，并保持了較高的增殖活性，凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 總RNA提取

從奶牛乳腺上皮細(xì)胞中提取的總RNA經(jīng)測(cè)定，各樣本 OD260nm/OD280nm均介于1.9～2.1之間，表明總RNA純度較高。另外，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明總RNA完整性較好?？傊俁NA樣本質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

2.3 GHR和IGF-ⅠR mRNA的表達(dá)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳觀察到與目的片段大小相吻合的條帶(圖2)，且無雜帶產(chǎn)生，表明該試驗(yàn)中體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠表達(dá) GHR和 IGF-ⅠR mRNA，GH和 IGF-Ⅰ通過作用于乳腺上皮細(xì)胞上的相應(yīng)的受體來發(fā)揮各自的作用。

2.4 GH和IGF-Ⅰ對(duì)κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量的影響

由圖3可見，在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上單獨(dú)添加100 ng/mL的GH或IGF-Ⅰ均能顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，二者聯(lián)合添加也能顯著促進(jìn)κ-酪蛋白mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，但與2個(gè)單獨(dú)添加組差異不顯著(P＞0.05)。

RT-qPCR熔解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果表明無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，且擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的基因的片段大小相符合，表明較準(zhǔn)確地對(duì)κ-酪蛋白mRNA的表達(dá)進(jìn)行了相對(duì)定量。

表2 RT-qPCR各基因引物序列Table2 Sequences of primers for the RT-qPCR

圖1 復(fù)蘇后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)狀況Fig.1 Status of adherence and growth of bovine mammary epithelial cells after resuscitated

2.5 GH和IGF-Ⅰ對(duì)乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)量的影響

由表3可見，在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給奶牛乳腺上皮細(xì)胞補(bǔ)充 GH、IGF-Ⅰ或 GH+IGF-Ⅰ，處理 24 h 后對(duì) JAK2、STAT5、4EBP1、真核生物起始因子4E(eIF4E)、真核生物延伸因子2(eEF2)mRNA的表達(dá)量沒有顯著影響(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，GH組ELF5 mRNA表達(dá)量有提高的趨勢(shì)(P＜0.10)。IGF-Ⅰ組哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖體蛋白S6激酶1(rpS6K1)mRNA的表達(dá)量顯著提高(P＜0.05)。盡管GH+IGF-Ⅰ組rpS6K1 mRNA表達(dá)量顯著提高(P＜0.05)，但其表達(dá)量與IGF-Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05)。

各基因RT-qPCR反應(yīng)熔解曲線均為單一峰，無任何雜峰出現(xiàn)，此外，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各基因擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，且符合擴(kuò)增產(chǎn)物大小，表明RT-qPCR過程中無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，較準(zhǔn)確地定量了各基因mRNA的表達(dá)量。

圖2 GHR和IGF-ⅠR基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram for PCR products of GHR and IGF-ⅠR genes

圖3 κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量Fig.3 The mRNA expression level of CSN3

3 討論

3.1 GH和IGF-Ⅰ對(duì)κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量的影響

乳蛋白主要由酪蛋白(αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白)和清蛋白(α-乳白蛋白、β-乳球蛋白)組成，為了解釋GH和IGF-Ⅰ促進(jìn)乳蛋白合成的機(jī)理，許多國(guó)外學(xué)者做了相關(guān)的研究，Yang等[20]和Sakamoto等[19]于同年分別發(fā)現(xiàn)了GH對(duì)奶牛乳腺組織β-酪蛋白基因表達(dá)的促進(jìn)作用和GH提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞αs1-酪蛋白基因表達(dá)、蛋白合成的作用，同時(shí)用免疫組化法檢測(cè)到了GHR基因的表達(dá)，近年來，Johnson等[28]在奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)GH可提高αs1-酪蛋白基因表達(dá)量，此外還發(fā)現(xiàn)GH可促進(jìn)α-乳白蛋白基因的表達(dá)，同時(shí)在MAC-T細(xì)胞上檢測(cè)到了GHR基因的表達(dá)。原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞多次經(jīng)過傳代后，αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白基因表達(dá)量均有所下降，但κ-酪蛋白基因表達(dá)量比其他酪蛋白更穩(wěn)定，此外，κ-酪蛋白是4種酪蛋白中的一種極其重要的種類，它不但能促進(jìn)酪蛋白膠束的形成，還影響乳的許多物理特性[29]，κ-酪蛋白的糖基化程度可影響泌乳量、蛋白和酪蛋白含量[30]，κ-酪蛋白基因敲除的小鼠乳酪蛋白膠束不穩(wěn)定且不能泌乳[31]。鑒于κ-酪蛋白的重要性及其基因表達(dá)的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)選擇了κ-酪蛋白為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)GH能顯著促進(jìn)κ-酪蛋白基因的表達(dá)，這與Zhou等[24]的研究結(jié)果不一致，他們發(fā)現(xiàn)GH能顯著促進(jìn)αs1-、αs2-、β-酪蛋白以及α-乳白蛋白基因的表達(dá)，κ-酪蛋白基因的表達(dá)有所提高但差異不顯著，原因可能與細(xì)胞來源和處理方式的不同有關(guān)，Zhou等[24]利用的是轉(zhuǎn)染了GHR和STAT5基因的MAC-T細(xì)胞且處理方式為單一添加GH，而本試驗(yàn)則是用從奶牛乳腺組織中分離培養(yǎng)并傳代純化后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，處理方式是在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加GH。關(guān)于IGF-Ⅰ對(duì)酪蛋白基因表達(dá)量的研究尚未見報(bào)道，Burgos等[21]近年來報(bào)道了 IGF-Ⅰ能顯著促進(jìn)MAC-T細(xì)胞總蛋白的合成，而本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ能顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量。與對(duì)照組相比，GH和IGF-Ⅰ同時(shí)添加到無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中顯著促進(jìn)了κ-酪蛋白mRNA表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)協(xié)同或累積效應(yīng)，聯(lián)合添加GH與IGF-Ⅰ與單獨(dú)添加GH或IGF-Ⅰ促進(jìn)κ-酪蛋白mRNA表達(dá)的效果差異不顯著。另外，本試驗(yàn)檢測(cè)到了GHR和IGF-ⅠR mRNA在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)，表明GH和IGF-Ⅰ通過與細(xì)胞受體結(jié)合激活胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)酪蛋白的表達(dá)。

表3 GH和IGF-Ⅰ對(duì)乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)量的影響Table3 Effects of GH and IGF-Ⅰon mRNA expression levels of key kinases and factors regulating milk protein synthesis

3.2 GH和IGF-Ⅰ對(duì)乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的影響

乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄可受到JAK2-STAT5信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，而JAK2-STAT5信號(hào)通路可能是多種激素的共同作用路徑。當(dāng)胞內(nèi)激素受體與激素結(jié)合后發(fā)生二聚，引起交叉磷酸化，使得JAK2被激活并發(fā)生酪氨酸磷酸化，為STAT5提供停留位點(diǎn)，進(jìn)而使STAT5在JAK2的作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化的STAT5發(fā)生二聚移向細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA結(jié)合，激活乳蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄[32-33]。另外，該信號(hào)通路對(duì)于乳腺發(fā)育、乳腺上皮細(xì)胞的增殖與分化也發(fā)揮重要作用，無JAK2的小鼠在分娩時(shí)不但不能形成分泌腺泡而且激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖嚴(yán)重減少[34]。反芻動(dòng)物與嚙齒類動(dòng)物不同，乳蛋白基因的高表達(dá)并非主要通過催乳素調(diào)控STAT5活性來實(shí)現(xiàn)，GH和IGF-Ⅰ可能也發(fā)揮了很大的作用[35]。一方面，GH和IGF-Ⅰ也可以調(diào)控STAT5-DNA結(jié)合活性。高濃度或生理范圍的催乳素、GH或IGF-Ⅰ均能提高體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織的STAT5-DNA結(jié)合活性，同時(shí)添加GH和催乳素的奶牛乳腺組織的STAT5活性顯著高于單一添加其中一種激素[36]。另一方面，GH和IGF-Ⅰ可能對(duì)STAT5的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響。Boutinaud等[37]給奶山羊每日外源補(bǔ)充GH，23 d后發(fā)現(xiàn)GH顯著提高了乳腺STAT5蛋白合成量和基因表達(dá)量，而本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加GH和IGF-Ⅰ在24 h內(nèi)不影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞JAK2和STAT5 mRNA的表達(dá)。Yang等[36]也發(fā)現(xiàn)GH和IGF-Ⅰ在短時(shí)間內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織STAT5蛋白豐度沒有影響，因此GH和IGF-Ⅰ對(duì)STAT5基因表達(dá)和STAT5蛋白合成產(chǎn)生明顯作用可能需要較長(zhǎng)的作用時(shí)間，而短時(shí)間內(nèi)它們可促進(jìn)STAT5-DNA結(jié)合活性。ELF5屬于ETS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，它不但能夠調(diào)控乳腺細(xì)胞JAK2-STAT5信號(hào)通路，明顯促進(jìn)STAT5活性，而且它自身的基因表達(dá)也受到STAT5的調(diào)控[38-39]。缺少ELF5基因的小鼠乳腺STAT5的基因表達(dá)量和蛋白活性降低[40]，進(jìn)而引起小鼠乳蛋白合成的下降[41]，這可能是因?yàn)镋LF5可通過抑制細(xì)胞因子信號(hào)抑制物(SOCS)基因表達(dá)來提高STAT5的活性[40]。雖然在奶牛乳腺組織上也發(fā)現(xiàn)了ELF5對(duì)乳蛋白合成起重要作用[24]，但關(guān)于GH和IGF-Ⅰ對(duì)ELF5基因表達(dá)量的影響到目前尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)盡管GH在24 h內(nèi)沒有顯著促進(jìn)ELF5 mRNA的表達(dá)，但有提高其表達(dá)量的趨勢(shì)，沒有進(jìn)一步影響到STAT5 mRNA的表達(dá)。

3.3 GH和IGF-Ⅰ對(duì)乳蛋白翻譯的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子的影響

mTOR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成上的作用已被廣泛證實(shí)，其下游靶標(biāo)rpS6K1、4EBP1、eEF2等在蛋白質(zhì)翻譯起始或延伸過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。mTOR通過提高rpS6K1的活性促使核糖體蛋白S6發(fā)生磷酸化進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯起始和延伸的進(jìn)行[42-43];通過促進(jìn) 4EBP1磷酸化使eIF4E得以解離并與真核生物起始因子4G(eIF4G)、真核生物起始因子4A(eIF4A)等起始因子等形成eIF4F起始復(fù)合物，啟動(dòng)含帽子結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯起始[44];eEF2受到 eEF2激酶的調(diào)節(jié)，rpS6K1可使其下游的eEF2激酶發(fā)生磷酸化以抑制eEF2激酶活性，這有利于eEF2發(fā)生去磷酸化，進(jìn)而使翻譯延伸能夠順利進(jìn)行[42]。前人在奶牛乳腺上的研究已發(fā)現(xiàn)了rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2 等對(duì)乳蛋白合成有重要作用[23，45-47]。基于這些研究的基礎(chǔ)之上，本試驗(yàn)選擇了在翻譯水平調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E 和 eEF2，觀察它們的 mRNA表達(dá)量是否受到GH和IGF-Ⅰ的影響。研究結(jié)果表明在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給奶牛乳腺上皮細(xì)胞補(bǔ)充GH沒有顯著影響mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2 mRNA 的表達(dá)量，這與Hayashi等[16]的奶牛體內(nèi)研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)給奶牛皮下注射GH顯著提高了乳蛋白產(chǎn)量及奶牛乳腺 eIF4E和 eEF2的蛋白豐度，但eIF4E、mTOR和 eEF2 mRNA表達(dá)量未受影響。GH可能在調(diào)控mTOR下游靶標(biāo)磷酸化水平上有重要作用，因?yàn)樵诟伟┘?xì)胞上的研究證明了mTOR信號(hào)通路在GH對(duì)蛋白質(zhì)合成的快速激活中發(fā)揮重要作用，且能促進(jìn)mTOR下游靶標(biāo)的磷酸化[48]，但在乳腺上皮細(xì)胞上是否存在同樣的作用需要進(jìn)一步的研究。Burgos等[21]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T細(xì)胞為研究模型，發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ在顯著提高蛋白質(zhì)合成同時(shí)顯著提高了S6K1、4EBP1磷酸化水平以及eIF4G與eIF4E的結(jié)合量，并顯著降低4EBP1與eIF4E的結(jié)合量，而IGF-Ⅰ是否影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞mTOR、rpS6K1、4EBP1、eIF4E、eEF2基因的表達(dá)量尚未見報(bào)道，在本試驗(yàn)條件下IGF-Ⅰ顯著促進(jìn)了mTOR和rpS6K1 mRNA的表達(dá)量，其他基因未受到影響。研究發(fā)現(xiàn)GH可通過抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5(IGFBP-5)基因的表達(dá)，降低 IGFBP-5對(duì) IGF-Ⅰ的高親和力來促進(jìn)IGF-Ⅰ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的作用[49]，表明GH和IGF-Ⅰ存在一定的協(xié)同作用，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合添加GH和IGF-Ⅰ雖能顯著提高rpS6K1 mRNA的表達(dá)量，但與單獨(dú)添加IGF-Ⅰ產(chǎn)生的作用差異不顯著，另外GH+IGF-Ⅰ對(duì)κ-酪蛋白mRNA的表達(dá)量也未發(fā)現(xiàn)累積效應(yīng)，因此GH和IGF-Ⅰ對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的協(xié)同作用可能表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡方面，這尚需進(jìn)一步的研究。綜合前人和本試驗(yàn)的研究結(jié)果，GH和IGF-Ⅰ可能在基因表達(dá)、蛋白豐度以及磷酸化水平多個(gè)層次下調(diào)控參與調(diào)節(jié)乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶和調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白的合成，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)理仍需進(jìn)一步通過大量的體內(nèi)外試驗(yàn)研究來確證。

4 結(jié)論

①在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞補(bǔ)充GH和IGF-Ⅰ能夠顯著提高κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量，這是GH和IGF-Ⅰ通過分別作用于其受體來激活胞內(nèi)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，但未發(fā)現(xiàn)GH和IGF-Ⅰ在促進(jìn)κ-酪蛋白mRNA表達(dá)量方面存在聯(lián)合效應(yīng)。

②在本試驗(yàn)條件下，單獨(dú)補(bǔ)充GH有促進(jìn)ELF5 mRNA表達(dá)量的趨勢(shì);單獨(dú)添加IGF-Ⅰ可顯著提高mTOR和rpS6K1 mRNA表達(dá)量，但GH沒有進(jìn)一步加強(qiáng)IGF-Ⅰ的這種作用，表明 GH和IGF-Ⅰ可單獨(dú)通過影響調(diào)控乳蛋白合成的關(guān)鍵激酶及調(diào)節(jié)因子基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)κ-酪蛋白的合成。

致謝:

感謝揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院李建基教授、王亨副教授在奶牛乳腺手術(shù)活體采樣上給予的大力幫助;感謝徐柏林碩士在奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)上給予的耐心指導(dǎo)。

[1]CHILLIARD Y，CISSE M，LEFAIVRE R，et al.Body composition ofdairy cows according to lactation stage，somatotropin treatment，and concentrate supplementation[J].Journal of Dairy Science，1991，74(9):3103-3116.

[2]EPPARD P J，BAUMAN D E，MCCUTCHEON S N.Effect of dose of bovine growth hormone on lactationof dairy cows[J].Journal of Dairy Science，1985，68(5):1109-1115.

[3]LOUGH D S，MULLER L D，KENSINGER R S，et al.Effect of exogenous bovine somatotropin on mammary lipid metabolism and milk yield in lactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science，1989，72(6):1469-1476.

[4]PEEL C J，F(xiàn)RONK T J，BAUMAN D E，et al.Effect of exogenous growth hormone in early and late lactation on lactational performance of dairy cows[J].Journal of Dairy Science，1983，66(4):776-782.

[5]PEEL C J，BAUMAN D E，GOREWIT R C，et al.Effect of exogenous growth hormone on lactational performance in high yielding dairy cows[J].The Journal of Nutrition，1981，111(9):1662-1671.

[6]MACHLIN L J.Effect of growth hormone on milk production and feed utilization in dairy cows[J].Journal of Dairy Science，1973，56(5):575-580.

[7]MOLENTO C F，BLOCK E，CUE R I，et al.Effects of insulin，recombinant bovine somatotropin，and their interaction on insulin-like growth factor-Ⅰsecretion and milk protein production in dairy cows[J].Journal of Dairy Science，2002，85(4):738-747.

[8]SARTIN J L，CUMMINS K A，KEMPPAINEN R J，et al.Glucagon，insulin，and growth hormone responses to glucose infusion in lactating dairy cows[J].American Journal of Physiology，1985，248:E108-E114.

[9]BALDI A，MODINA S，CHELI F，et al.Bovine somatotropin administration to dairy goats in late lactation:effects on mammary gland function，composition and morphology[J].Journal of Dairy Science，2002，85(5):1093-1102.

[10]BAUMAN D E.Bovine somatotropin and lactation:from basic science to commercial application[J].Domestic Animal Endocrinology，1999，17(2/3):101-116.

[11]VELEZ J C，DONKIN S S.Bovine somatotropin increases hepatic phosphoenolpyruvate carboxykinase mRNA in lactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science，2004，87(5):1325-1335.

[12]ROSE M T，WEEKES T E，ROWLINSON P.Correlation of blood and milk components with the milk yield response to bovine somatotropin in dairy cows[J].Domestic Animal Endocrinology，2005，28(3):296-307.

[13]GLIMM D R，BARACOS V E，KENNELLY J J.Molecular evidence for the presence of growth hormone receptors in the bovine mammary gland[J].Journal of Endocrinology，1990，126(3):R5-R8.

[14]BAUMRUCKER C R，ERONDU N E.Insulin-like growth factor(IGF)system in the bovine mammary gland and milk[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia，2000，5(1):53-64.

[15]FLINT D J，GARDNER M.Evidence that growth hormone stimulates milk synthesis by direct action on the mammary gland and that prolactin exerts effects on milk secretion by maintenance of mammary deoxyribonucleic acid content and tight junction status[J].Endocrinology，1994，135(3):1119-1124.

[16]HAYASHI A A，NONES K，ROY N C，et al.Initiation and elongation steps of mRNA translation are involved in the increase in milk protein yield caused by growth hormone administration during lactation[J].Journal of Dairy Science，2009，92(5):1889-1899.

[17]PROSSER C G，DAVIS S R，F(xiàn)ARR V C，et al.Effects of close-arterial(external pudic)infusion of insulin-like growth factor-Ⅱon milk yield and mammary blood flow in lactating goats[J].Journal of Endocrinology，1994，142(1):93-99.

[18]PROSSER C G，F(xiàn)LEET I R，CORPS A N，et al.Increase in milk secretion and mammary blood flow by intra-arterial infusion of insulin-like growth factor-Ⅰinto the mammary gland of the goat[J].Journal of Endocrinology，1990，126(3):437-443.

[19]SAKAMOTO K，KOMATSU T，KOBAYASHI T，et al.Growth hormone acts on the synthesis and secretion of alpha-casein in bovine mammary epithelial cells[J].Journal of Dairy Research，2005，72(3):264-270.

[20]YANG J，ZHAO B，BARACOS V E，et al.Effects of bovine somatotropin on beta-casein mRNA levels in mammary tissue of lactating cows[J].Journal of Dairy Science，2005，88(8):2806-2812.

[21]BURGOS S A，CANT J P.IGF-1 stimulates protein synthesis by enhanced signaling through mTORC1 in bovine mammary epithelial cells[J].Domestic Animal Endocrinology，2010，38(4):211-221.

[22]YANG J，KENNELLY J J，BARACOS V E.Physiological levels of Stat5 DNA binding activity and protein in bovine mammary gland[J].Journal of Animal Science，2000，78(12):3126-3134.

[23]BURGOS S A，DAI M，CANT J P.Nutrient availability and lactogenic hormones regulate mammary protein synthesis through the mammalian target of rapamycin signaling pathway[J].Journal of Dairy Science，2010，93(1):153-161.

[24]ZHOU Y，AKERS R M，JIANG H.Growth hormone can induce expression of four major milk protein genes in transfected MAC-T cells[J].Journal of Dairy Science，2008，91(1):100-108.

[25]BIONAZ M，LOOR J J.Gene networks driving bovine mammary protein synthesis during the lactation cycle[J].Bioinformatics and Biology Insights，2011，5:83-98.

[26]PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Research，2001，29(9):e45.

[27]RAMAKERS C，RUIJTER J M，DEPREZ R H，et al.Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction(PCR)data[J].Neuroscience Letters，2003，339(1):62-66.

[28]JOHNSON T L ，F(xiàn)UJIMOTO B A ，JIMENEZFLORES R，et al.Growth hormone alters lipid composition and increases the abundance of casein and lactalbumin mRNA in the MAC-T cell line[J].Journal of Dairy Research，2010，77(2):199-204.

[29]GUTIERREZ-ADAN A，MAGA E A，MEADE H，et al.Alterations of the physical characteristics of milk from transgenic mice producing bovine kappa-casein[J].Journal of Dairy Science，1996，79(5):791-799.

[30]ROBITAILLE G，NG-KWAI-HANG K F，MONARDES H G.Association of kappa-casein glycosylation with milk production and composition in Holsteins[J].Journal of Dairy Science，1991，74(10):3314-3317.

[31]SHEKAR P C，GOEL S，RANI S D，et al.Kappa-casein-deficient mice fail to lactate[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103(21):8000-8005.

[32]WHEELER T T，KUYS Y M，BROADHURST M M，et al.Mammary STAT5 abundance and activity are not altered with lactation state in cows[J].Molecular and Cellular Endocrinology，1997，133(2):141-149.

[33]BUITENHUIS M，COFFER P J，KOENDERMAN L.Signal transducer and activator oftranscription 5(STAT5)[J].The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2004，36(11):2120-2124.

[34]SHILLINGFORD J M，MIYOSHI K，ROBINSON G W，et al.Jak2 is an essential tyrosine kinase involved in pregnancy-mediated development of mammary secretory epithelium [J].Molecular Endocrinology，2002，16(3):563-570.

[35]WHEELER T T，BROADHURST M K，SADOWSKI H B，et al.Stat5 phosphorylation status and DNA-binding activity in the bovine and murine mammary glands[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2001，176(1/2):39-48.

[36]YANG J，KENNELLY J J，BARACOS V E.The activity of transcription factor STAT5 responds to prolactin，growth hormone，and IGF-Ⅰ in rat and bovine mammary explant culture[J].Journal of Animal Science，2000，78(12):3114-3125.

[37]BOUTINAUD M，JAMMES H.Growth hormone increases Stat5 and Stat1 expression in lactating goat mammary gland:a specific effect compared to milking frequency[J].Domestic AnimalEndocrinology，2004，27(4):363-378.

[38]ROGERS R L，VAN SEUNINGEN I，GOULD J，et al.Transcript profiling of Elf5+/-mammary glands during pregnancy identifies novel targets of Elf5[J].PLoS One，2010，5(10):e13150.

[39]DONG J，TONG T，REYNADO A M，et al.Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones[J].Developmental Biology，2010，346(2):196-203.

[40]CHOI Y S，CHAKRABARTI R，ESCAMILLA-HERNANDEZ R，et al.Elf5 conditional knockout mice reveal its role as a master regulator in mammary alveolar development:failure of STAT5 activation and functional differentiation in the absence of Elf5[J].Developmental Biology，2009，329(2):227-241.

[41]ZHOU J，CHEHAB R，TKALCEVIC J，et al.Elf5 is essential for early embryogenesis and mammary gland development during pregnancy and lactation[J].The EMBO Journal，2005，24(3):635-644.

[42]WANG X，PROUD C G.The mTOR pathway in the control of protein synthesis[J].Physiology，2006，21:362-369.

[43]MAGNUSON B，EKIM B，F(xiàn)INGAR D C.Regulation and function of ribosomal protein S6 kinase(S6K)within mTOR signalling networks[J].Biochemical Journal，2012，441(1):1-21.

[44]FINGAR D C，SALAMA S，TSOU C，et al.Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E[J].Genes ＆Development，2002，16(12):1472-1487.

[45]TOERIEN C A，TROUT D R，CANT J P.Nutritional stimulation of milk protein yield of cows is associatedwith changes in phosphorylation of mammary eukaryotic initiation factor 2 and ribosomal S6 kinase 1[J].The Journal of Nutrition，2010，140(2):285-292.

[46]TOERIEN C A，CANT J P.Abundance and phosphorylation state of translation initiation factors in mammary glands of lactating and nonlactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science，2007，90(6):2726-2734.

[47]CHRISTOPHERSEN C T，KARLSEN J，NIELSEN M O，et al.Eukaryotic elongation factor-2(eEF-2)activity in bovine mammary tissue in relation to milk protein synthesis[J].Journal of Dairy Research，2002，69(2):205-212.

[48]HAYASHI A A，PROUD C G.The rapid activation of protein synthesis by growth hormone requires signaling through mTOR[J].American Journal of Physiology:Endocrinology and Metabolism，2007，292(6):E1647-E1655.

[49]SAKAMOTO K，YANO T，KOBAYASHI T，et al.Growth hormone suppresses the expression of IGFBP-5，and promotes the IGF-Ⅰ-induced phosphorylation of Akt in bovine mammary epithelial cells[J].Domestic Animal Endocrinology，2007，32(4):260-272.