大鼠腦內(nèi)雙核團(tuán)電活動(dòng)與多項(xiàng)生理指標(biāo)的同步記錄技術(shù)

劉 偉，汪偉偉，黃 軍，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 1．細(xì)胞電生理研究室;2．生理學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科“啟明星小組”，安徽 蕪湖 241002)

人類的生命活動(dòng)涉及生理活動(dòng)和心理活動(dòng)兩方面，這種心理生理活動(dòng)的統(tǒng)一性，也表現(xiàn)在諸多心理生理障礙和心身性疾病中，如藥物成癮、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等。以藥物成癮為例，其既包括精神依賴(psychological dependence)也包括軀體依賴(physical dependence)。軀體依賴可以隨著各種戒毒方法的應(yīng)用漸漸消退，但精神依賴卻可長(zhǎng)久存在，導(dǎo)致成癮者再次使用成癮藥物(復(fù)吸)［1］。成癮中精神依賴和軀體依賴的關(guān)系尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為精神依賴先出現(xiàn)，在反復(fù)的線索、獎(jiǎng)賞誘導(dǎo)下才出現(xiàn)了軀體依賴;但也有人提出至少在煙草成癮中精神依賴和軀體依賴是平行發(fā)生的［2］。目前關(guān)于藥物成癮的研究既有心理角度的摸索也有生理方面的探究，但多為分別進(jìn)行，僅偶見(jiàn)報(bào)道稱心理活動(dòng)與生理活動(dòng)的解偶聯(lián)(decoupling)可能是成癮機(jī)制之一［3］。同樣，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙除了心理障礙外，通常也伴有神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能改變，并引發(fā)軀體癥狀。由此可見(jiàn)，藥物成癮等精神類疾病或心身疾病的研究，亟需一種心理生理學(xué)綜合技術(shù)來(lái)較系統(tǒng)地揭示其可能的發(fā)病機(jī)制。為此，我們以藥物成癮為例，選擇了與藥物成癮密切相關(guān)的腦內(nèi)獎(jiǎng)賞和懲罰系統(tǒng)代表性核團(tuán)進(jìn)行同步細(xì)胞外記錄，并聯(lián)合多項(xiàng)生理指標(biāo)記錄的技術(shù)，為進(jìn)一步對(duì)藥物成癮的精神依賴和軀體依賴以及其他精神性疾病，從心理和生理兩方面同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用280～300 g成年SD大鼠26只，雌雄不拘，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1．2 儀器設(shè)備及藥品 常規(guī)動(dòng)物手術(shù)器械、雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩和防震臺(tái)、手術(shù)顯微鏡、腦立體定位儀、牙科鉆和保溫毯(上海奧爾科特生物科技有限公司)。不銹鋼同芯金屬電極、金屬參考電極和微電極放大器、PowerLab八通道生理信號(hào)采集與分析系統(tǒng)(AD Instruments，Australia)及其 Chart Pro記錄和分析軟件、20%烏拉坦等。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 多項(xiàng)生理指標(biāo)同步記錄 取大鼠用20%烏拉坦按1．5 g/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉穩(wěn)定后，將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，下墊保溫毯(設(shè)定溫度37．0℃)，放置在雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩內(nèi)的防震臺(tái)上。將體溫?fù)Q能器探頭置于大鼠肛門內(nèi)，進(jìn)行體溫信號(hào)的采集。在大鼠右前肢用針式電極插入腕關(guān)節(jié)上部的前臂皮下，左后肢用針式電極插入踝關(guān)節(jié)上部的大腿皮下，右后肢接地，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。將2根針式電極插入大鼠右側(cè)腋中線第9肋下緣肋間外肌內(nèi)，記錄呼吸肌肌電圖。將2塊板式皮膚電導(dǎo)電極，用醫(yī)用膠布分別固定于大鼠左前肢掌面和背面，記錄皮膚電導(dǎo)。

1．3．2 腦深部雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄 頭部備皮。調(diào)節(jié)耳桿使之左右對(duì)稱，固定大鼠頭部使之不能移動(dòng)。用手術(shù)刀切開(kāi)頭皮，3%H2O2擦拭充分止血，暴露顱骨標(biāo)志(前囟、人字縫)。調(diào)節(jié)前囟、人字縫到同一水平平面。定位腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA):前囟后(AP)－6．72 ～ －6．84 mm;右旁開(kāi)(R)0．4 ～1．13 mm;硬膜表面以下(DV)7．5 mm～8．5 mm。定位基底外側(cè)杏仁核(BLA):AP －1．56 ～ －3．36 mm;左旁開(kāi)(L)3．9 ～4．6 mm;DV 7．8 ～8．82 mm［4］。以牙科鉆鉆顱開(kāi)窗，手術(shù)顯微鏡下用顯微剪剪開(kāi)硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜，3%H2O2充分止血。使用金屬電極在操作臂的牽引下移至顱窗上，并緊貼腦組織，2%鹽水瓊脂封窗。安置好參考電極、接地電極。記錄電極接入放大、記錄系統(tǒng)。操縱電極下至目標(biāo)腦區(qū)后，微調(diào)電極尋找合適、明確的細(xì)胞外電活動(dòng)信號(hào)。

1．3．3 信號(hào)采集參數(shù)設(shè)置 所采集的6通道信號(hào)，經(jīng)換能器或放大器放大，接入PowerLab多導(dǎo)生理信號(hào)采集與分析系統(tǒng)，由計(jì)算機(jī)中Chart Pro軟件進(jìn)行采集、存盤，采樣頻率4 kHz。各通道參數(shù)設(shè)置如下:VTA、BLA電活動(dòng)信號(hào)高通10 Hz、低通2 kHz，體溫信號(hào)低通10 Hz，心電信號(hào)高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌電信號(hào)高通 0．1 Hz、低通 200 Hz，皮膚電導(dǎo)信號(hào)量程設(shè)為10μS。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取腦于4%甲醛溶液內(nèi)固定或冰凍后，進(jìn)行冠狀面切片，觀察針道位置與圖譜VTA、BLA的位置進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行記錄位點(diǎn)鑒定。

1．4 數(shù)據(jù)分析 記錄到的腦內(nèi)核團(tuán)電活動(dòng)信號(hào)，用Chart Pro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量和分析，并作有關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析等。幅值為Chart Pro軟件從選定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)的信號(hào)幅度最大值減去最小值，即信號(hào)的最大振幅值。呼吸肌肌電周期計(jì)算，使用Chart Pro軟件中周期測(cè)量(Cyclic measurements)功能，最小峰高S．D．設(shè)為5、濾波設(shè)為高通150 Hz、最小周期設(shè)為720 ms，將數(shù)據(jù)添加到數(shù)據(jù)板，可自動(dòng)算出均數(shù)，即為平均肌電周期(代表呼吸頻率)。結(jié)果以ˉx±s表示。用 Origin 5．0軟件(Microcal Software Inc，USA)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和作圖。P＜0．05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2．1 6通道同步記錄在對(duì)腦內(nèi)VTA、BLA核團(tuán)電活動(dòng)進(jìn)行同步細(xì)胞外記錄的同時(shí)，監(jiān)測(cè)體溫、心電、呼吸肌(肋間外肌)肌電、皮膚電導(dǎo)等生理指標(biāo)，1只大鼠典型的6通道同步記錄結(jié)果例示于圖1。

圖1 單只大鼠的6項(xiàng)心理生理學(xué)指標(biāo)同步記錄A為常規(guī)顯示，從上到下依次為:VTA電活動(dòng)(μV)、BLA電活動(dòng)(μV)、體溫(℃)、心電(μV)、呼吸肌肌電(μV)，皮膚電導(dǎo)(μS)。B為A圖中相應(yīng)生理指標(biāo)(虛線框)的放大

圖2 VTA和BLA同步記錄的放電頻率直方圖(Bin=10 s)

2．2 VTA和BLA電活動(dòng)特性及其相關(guān)性分析 放電頻率直方圖分析是細(xì)胞外記錄的主要分析方法，用以反映核團(tuán)或神經(jīng)元電活動(dòng)的頻率，進(jìn)而了解核團(tuán)電活動(dòng)的特性。1只大鼠VTA和BLA電活動(dòng)記錄的典型放電頻率直方圖分析例示于圖2。對(duì)26只大鼠各取穩(wěn)定記錄的VTA和BLA電信號(hào)20 min，用Chart Pro軟件檢測(cè)出平均頻率作為放電頻率值，結(jié)果顯示BLA的放電頻率(0．88±0．99)Hz高于 VTA(0．50 ±0．55)Hz，配對(duì) t檢驗(yàn)，P ＜0．01。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)分析(圖3)，表明BLA放電頻率與 VTA放電頻率呈正相關(guān)(r=0．936，P＜0．01)。進(jìn)一步對(duì)12只大鼠進(jìn)行6個(gè)通道記錄指標(biāo)的分析，亦顯示不僅BLA的放電頻率，其電活動(dòng)的幅值也高于 VTA(P ＜0．01，表1)。

2．3 生理指標(biāo)分析在12只大鼠進(jìn)行6個(gè)通道記錄指標(biāo)的分析中，同步記錄的4項(xiàng)生理指標(biāo)是體溫、皮膚電導(dǎo)、心電圖和呼吸肌肌電圖。應(yīng)用Chart Pro軟件對(duì)大鼠心電圖、肌電圖等生理指標(biāo)進(jìn)行分析，其呼吸肌肌電、體溫、皮膚電導(dǎo)和心電信號(hào)的基本測(cè)量結(jié)果列于表2。

圖3 大鼠VTA和BLA放電頻率的相關(guān)性分析

表1 大鼠VTA和BLA電活動(dòng)檢測(cè)結(jié)果(n=12)

表2 大鼠呼吸肌肌電、體溫、皮膚電導(dǎo)、心電信號(hào)檢測(cè)結(jié)果(n=12)

2．4 VTA和BLA電活動(dòng)與生理指標(biāo)間的相關(guān)性應(yīng)用本技術(shù)不僅可以分別對(duì)腦內(nèi)核團(tuán)間的電活動(dòng)進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)還可以進(jìn)行腦內(nèi)核團(tuán)電活動(dòng)與生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析。圖4例示了腦內(nèi)VTA和BLA電活動(dòng)與生理指標(biāo)的相關(guān)性記錄結(jié)果，圖中箭頭所指處先出現(xiàn)VTA和BLA電活動(dòng)的明顯減弱，接著出現(xiàn)呼吸肌肌電活動(dòng)的明顯增強(qiáng)，隨后1個(gè)間歇期延長(zhǎng)，呈現(xiàn)1次呼氣后期的深吸氣過(guò)程，稱之為“自發(fā)深呼吸反應(yīng)”，與實(shí)時(shí)觀察動(dòng)物活動(dòng)一致，并伴有明顯的皮膚電導(dǎo)反應(yīng)。

為進(jìn)一步分析上述現(xiàn)象，連續(xù)觀察穩(wěn)定信號(hào)，取自發(fā)深呼吸反應(yīng)期2 s，其前對(duì)照期2 s，進(jìn)行VTA和BLA核團(tuán)電活動(dòng)、心電、肌電、皮膚電導(dǎo)、體溫等指標(biāo)同步變化情況的參數(shù)檢測(cè)和分析。由圖4可見(jiàn)，各指標(biāo)的幅值檢測(cè)呈現(xiàn)反應(yīng)期腦內(nèi)核團(tuán)電活動(dòng)首先減弱，隨即呼吸肌肌電活動(dòng)增強(qiáng)，其后皮膚電導(dǎo)幅值增大。表3的數(shù)據(jù)分析表明，反應(yīng)期的VTA電活動(dòng)幅值減小(P＜0．05)，呼吸肌肌電幅值增大(P＜0．01)和皮膚電導(dǎo)幅值增大(P＜0．01)，同時(shí) BLA電活動(dòng)幅值有減小趨勢(shì)(P=0．07)。但心電指標(biāo)的變化沒(méi)有顯著性意義(P＞0．05)。圖4的各指標(biāo)變化時(shí)間順序，結(jié)合表3的數(shù)據(jù)分析，表明這種反應(yīng)的發(fā)生可能是源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)的改變，繼而導(dǎo)致生理活動(dòng)的變化。

圖4 腦內(nèi)VTA和BLA電活動(dòng)改變引起的外周生理指標(biāo)變化

表3 大鼠自發(fā)深呼吸反應(yīng)期各指標(biāo)的變化(ˉx±s，n=9)

2．5 傷害性刺激的影響 為檢測(cè)本技術(shù)能否反映外周傷害性刺激誘發(fā)的心理生理反應(yīng)，記錄過(guò)程中使用充分絕緣后的血管鉗夾持大鼠尾巴后1/3處(夾尾刺激)作為傷害性刺激，強(qiáng)度以后肢抽動(dòng)為適宜強(qiáng)度。以?shī)A尾刺激前各指標(biāo)信號(hào)為基礎(chǔ)水平(100%)，對(duì)夾尾時(shí)、夾尾后信號(hào)作歸一化處理，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(n=12)。

由圖5可知，與基礎(chǔ)水平相比VTA放電頻率在夾尾時(shí)比夾尾前顯著性降低(P＜0．001)，夾尾后比夾尾前顯著性升高(P＜0．05)。BLA放電頻率在夾尾刺激時(shí)降低(P＜0．05)，刺激停止后發(fā)放頻率恢復(fù)并有超過(guò)基礎(chǔ)水平的趨勢(shì)。

圖5 夾尾刺激誘發(fā)的VTA和BLA放電頻率變化

對(duì)夾尾刺激過(guò)程中的BLA和VTA電活動(dòng)幅值進(jìn)行分析顯示(圖6)，夾尾時(shí)BLA和VTA電活動(dòng)幅值相比夾尾前均下降(VTA:P＜0．001，BLA:P＜0．01)，夾尾刺激結(jié)束后BLA和VTA電活動(dòng)幅值都回升(VTA:P ＜0．001，BLA:P ＜0．01)。

圖6 夾尾刺激誘發(fā)VTA和BLA電活動(dòng)幅值的變化

同時(shí)，對(duì)夾尾刺激誘發(fā)生理指標(biāo)的變化進(jìn)行分析顯示(圖7)，心電信號(hào)RR間期與夾尾前相比在夾尾時(shí)顯著性縮短(P＜0．01)，刺激結(jié)束后雖然有所恢復(fù)，但仍短于夾尾前(P＜0．05)。呼吸肌肌電幅值在夾尾時(shí)僅有升高的趨勢(shì)(配對(duì)t檢驗(yàn)，P=0．11)，夾尾后比夾尾前降低(P ＜0．001)。其他指標(biāo)如R波幅值、皮膚電導(dǎo)幅值(數(shù)據(jù)未顯示)等的變化均沒(méi)有顯著性意義。

圖7 夾尾刺激誘發(fā)RR間期、呼吸肌肌電幅值的變化

3 討論

基于心理活動(dòng)與生理活動(dòng)相統(tǒng)一的心理生理學(xué)觀點(diǎn)，以及利用多導(dǎo)生理記錄儀記錄皮膚電導(dǎo)、心率、脈搏、心電、呼吸、面部肌電和腦電等信號(hào)來(lái)進(jìn)行人的情緒評(píng)估等心理生理學(xué)技術(shù)［5］，本文報(bào)道了在麻醉大鼠進(jìn)行腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄和多導(dǎo)生理指標(biāo)同步記錄的技術(shù)，其中腦內(nèi)核團(tuán)選擇了與藥物成癮密切相關(guān)的腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)與懲罰系統(tǒng)代表性核團(tuán)VTA和BLA電活動(dòng)為例，與多項(xiàng)生理指標(biāo)的活動(dòng)觀察相結(jié)合，進(jìn)行相互關(guān)系的分析，結(jié)果表明是一種可行的綜合性心理生理學(xué)研究技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本方法可以較好地同步記錄腦內(nèi)VTA與BLA雙核團(tuán)電活動(dòng)和多項(xiàng)生理活動(dòng)信號(hào)，并對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行系統(tǒng)地分析(如心電、肌電)，也可以做與其他信號(hào)之間的相關(guān)性分析。在實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有使用傳統(tǒng)有創(chuàng)的氣管插管法和膈肌肌電活動(dòng)評(píng)估呼吸功能的做法，而是改進(jìn)了文獻(xiàn)報(bào)道的“打開(kāi)腹腔從腋前線第9肋骨下緣刺入電極，不會(huì)穿透胸膜傷及肺”的操作［6］，直接將電極經(jīng)皮插入相應(yīng)位置，記錄肋間肌肌電活動(dòng)。本文所檢測(cè)到肋間肌肌電頻率與同等條件下大鼠呼吸頻率相符，各項(xiàng)指標(biāo)均與相關(guān)報(bào)道基本一致［7－11］。

本文還觀察到大鼠的自發(fā)深呼吸反應(yīng)現(xiàn)象。從記錄結(jié)果看，先出現(xiàn)腦內(nèi)核團(tuán)電活動(dòng)改變，繼而呼吸肌肌電幅值升高、皮膚電導(dǎo)幅值增大。從各指標(biāo)變化時(shí)間順序來(lái)看，可能是VTA和BLA核團(tuán)電活動(dòng)的改變導(dǎo)致了外周生理活動(dòng)反應(yīng)，這無(wú)疑為本技術(shù)作為心理生理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法的建立提供了支持。從自發(fā)深呼吸反應(yīng)的現(xiàn)象看，推測(cè)可能是中樞缺氧導(dǎo)致的腦內(nèi)神經(jīng)活動(dòng)受到抑制，進(jìn)而誘發(fā)一次深呼吸反應(yīng)。不過(guò)，本文尚未能對(duì)該現(xiàn)象的機(jī)制和意義進(jìn)行分析，有待于進(jìn)一步的研究。此外，傷害性?shī)A尾刺激誘發(fā)的反應(yīng)則是由外周刺激引發(fā)的腦內(nèi)活動(dòng)改變和生理活動(dòng)變化，而VTA和BLA核團(tuán)與傷害性刺激引起的痛覺(jué)反應(yīng)也密切相關(guān)，故以此了解本實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)外周刺激誘發(fā)反應(yīng)的監(jiān)測(cè)情況。結(jié)果顯示VTA和BLA電活動(dòng)都在夾尾時(shí)受到抑制，夾尾后恢復(fù)并超過(guò)原來(lái)基礎(chǔ)水平，但不同核團(tuán)對(duì)刺激的響應(yīng)程度不同。與此類似，不同的生理信號(hào)對(duì)夾尾刺激的反應(yīng)也不同，心電RR間期在夾尾時(shí)減小，夾尾后逐漸升高，呼吸肌肌電幅值則在夾尾時(shí)有升高趨勢(shì)，夾尾后降低，顯示了傷害性?shī)A尾刺激可引起一定特異性生理反應(yīng)。以上結(jié)果說(shuō)明，本文所建立的大鼠腦內(nèi)雙核團(tuán)細(xì)胞外記錄與多項(xiàng)生理指標(biāo)聯(lián)合記錄的心理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，既可以檢測(cè)由腦內(nèi)活動(dòng)變化引發(fā)的外周生理活動(dòng)改變，也可以反映外周刺激誘發(fā)的中樞及外周生理活動(dòng)變化。

本實(shí)驗(yàn)表明，該實(shí)驗(yàn)方法的特點(diǎn)表現(xiàn)在一方面可以在活體動(dòng)物上同時(shí)對(duì)兩處深部核團(tuán)進(jìn)行細(xì)胞外電信號(hào)記錄，進(jìn)而在整體條件下進(jìn)行相關(guān)功能核團(tuán)間的相互作用分析，以藥物成癮研究為例，就可以進(jìn)行腦內(nèi)獎(jiǎng)賞和懲罰系統(tǒng)相關(guān)核團(tuán)功能聯(lián)系和相互影響的分析。另一方面可以實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)生理指標(biāo)同步記錄，不僅可以了解腦內(nèi)功能活動(dòng)對(duì)外周生理功能的影響，而且能通過(guò)多項(xiàng)生理功能的比較分析其反應(yīng)模式的特異性，實(shí)現(xiàn)心理生理學(xué)研究的目標(biāo)。以藥物成癮研究為例，不僅大鼠藥物成癮出現(xiàn)戒斷反應(yīng)的體征［12］可反映在所檢測(cè)的生理指標(biāo)變化上，同時(shí)有關(guān)“心理-渴求偶聯(lián)”在成癮者中會(huì)發(fā)生改變［13］的特征亦可得到觀察，故能較為全面地分析藥物成癮軀體依賴導(dǎo)致的生理指標(biāo)變化。由此可見(jiàn)，該實(shí)驗(yàn)技術(shù)是從心理學(xué)和生理學(xué)交叉技術(shù)的角度，聯(lián)合分析心理生理指標(biāo)，為藥物成癮等心身疾病機(jī)制的綜合性研究提供了一種實(shí)用的技術(shù)。

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