靶向COL1A1基因的shRNA對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲與遷移的影響

余海浪，馬文麗*，周玨宇，孟 偉，石 嶸，鄭文嶺

(1.南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515;2.華南基因組研究中心，廣東廣州510800)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已成為乳腺癌患者死亡的主要原因。Ⅰ型膠原α1鏈基因(collagen type 1 alpha 1，COL1A1)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，對(duì)細(xì)胞的黏附、分化有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1基因在乳腺導(dǎo)管癌和乳腺小葉癌中均有不同程度的高表達(dá)，并且可能與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移存在一定相關(guān)性［1－2］。有關(guān)COL1A1基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制國內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾技術(shù)體外下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1的表達(dá)，并檢測干擾前后乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的變化，為尋找乳腺癌基因靶向治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(南方醫(yī)科大學(xué)基因所保存);小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3(中科院上海細(xì)胞所);pSilencer2.1-U6-COL1A1(pshRNACOL1A1)、pSilencer2.1-U6-scramble(pshRNAScramble)重組質(zhì)粒均(南方醫(yī)科大學(xué)基因所前期構(gòu)建);Transwell小室(Corning公司);Matrigel(BD公司)LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);COL1A1鼠抗人多克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG(北京中山公司);G418、氨芐青霉素、MTT、Giemsa(Sigma公司)

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank人COL1A1基因全長 mRNA序列(NM_000088)，按照Tuschl設(shè)計(jì)原則［3］，選取其中兩個(gè)位點(diǎn)TGAAGG AACGGTGTATGAA(877－895)和 GTACGTCCGGTT GTATGTA(2065－2083)作為靶序列，分別命名為pshRNA-COL1A1-1和 pshRNA-COL1A1-2，另 將pshRNA-COL1A1-2隨機(jī)打亂順序的序列作為陰性對(duì)照，命名為pshRNA-scramble，所有序列均經(jīng)Blast比較，與人、鼠基因庫無明顯同源性。根據(jù)不同靶點(diǎn)序列及pSilencerTM2.1-U6 neo表達(dá)載體的克隆需要合成發(fā)夾shRNA轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸序列，將寡核苷酸片段退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)后與線性化的pSilencerTM2.1-U6 neo載體連接，連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，轉(zhuǎn)化并擴(kuò)增獲得pSilencer/neo-shRNA表達(dá)質(zhì)粒并測序。

1.2.2 pshRNA-COL1A1表達(dá)載體的構(gòu)建:乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清的RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)傳代。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)參照LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)產(chǎn)品說明書，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞匯合達(dá)90% ～95%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用OPTI-MEM培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒載體和脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染后24 h在培養(yǎng)液中加入1 mg/mL G418進(jìn)行篩選。形成陽性單細(xì)胞克隆群落后，用尖吸管吸取單克隆陽性細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3周后以含400 mg/L G418的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot檢測COL1A1蛋白表達(dá)水平:采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，每孔上樣50 μg進(jìn)行10%SDS-PAGE，半干電轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后依次與鼠抗人COL1A1多抗(1∶200)、兔抗人 β-actin(1∶1 000)單抗4 ℃過夜，再與羊抗鼠IgG/HRP及羊抗兔IgG/HRP孵育37℃孵育1 h，ECL顯色。Scion Image軟件進(jìn)行吸光度掃描分析蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.2.4 平板集落形成實(shí)驗(yàn):細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長期后，以每孔500個(gè)細(xì)胞分別接種于含2 mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，肉眼觀察集落形成情況，終止培養(yǎng)后常規(guī)PBS漂洗，甲醇固定，Giemsa染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)，用下式計(jì)算集落形成率:集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn):參照Yang等［4］方法稍加修飾，Matrigel 1∶8稀釋液(100 μL/孔)包被 96 孔培養(yǎng)板后4℃過夜。吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50 μL RPMI1640無血清培養(yǎng)液，37℃孵育30 min待用。分別取各組單細(xì)胞懸液100 μL(5×103個(gè)/孔)接種于包被Matrigel的96孔板中，每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔。48 h后，37℃ PBS洗去未黏附的細(xì)胞，黏附細(xì)胞經(jīng)MTT細(xì)胞增殖試劑測定吸光度值進(jìn)行評(píng)估，以A值大小表示黏附活細(xì)胞數(shù)的相對(duì)多少。

1.2.6 侵襲實(shí)驗(yàn):采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力［5］。將50 μg/L的 Matrigel稀釋液均勻平鋪在Transwell上室內(nèi)，下室加NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清作為趨化因子。取各組轉(zhuǎn)染48 h的單細(xì)胞懸液100 μL(1 ×105個(gè)/室)接種于 Transwell上室內(nèi)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，棉簽輕輕擦去未穿膜細(xì)胞和Matrigel膠，取膜、甲醇固定、Giemsa染色，風(fēng)干，揭下濾膜后反貼在載玻片上。取倒置顯微鏡下隨機(jī)3個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的平均穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 遷移實(shí)驗(yàn):不鋪Matrigel膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測COL1A1基因沉默后COL1A1蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1蛋白抑制率分別為45.50% ±2.71%和66.98% ±2.08%，顯著高于空白對(duì)照組的2.07%±0.13%和陰性對(duì)照組的3.11% ±0.20%(P＜0.05)(圖1)。且實(shí)驗(yàn)組pshRNA-COL1A1-2中細(xì)胞COL1A1蛋白相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)程度大于實(shí)驗(yàn)組pshRNA-COL1A1-1，因此選取pshRNA-COL1A1-2(pshRNA-COL1A1)實(shí)驗(yàn)組作為有效干擾組進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞COL1A1的蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of COL1A1 after being transfected

2.2 特異性pshRNA-COL1A1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞集落形成的影響

pshRNA-COL1A1組細(xì)胞平均集落形成率(43.76% ±1.56%)與control組(76.68% ±1.34%)和pshRNA-scramble組(72.68% ±0.77%)相比顯著降低(P＜0.05)(圖2)。

2.3 特異性pshRNA-COL1A1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞黏附的影響

pshRNA-COL1A1組細(xì)胞的黏附能力明顯受抑制，其A值0.21±0.06顯著低于control組和pshRNA-scramble組的0.42±0.04和0.40±0.02(P＜0.001)(圖3)。

圖2 各組細(xì)胞平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 2 The results of monolayer colony formation assay in different groups(×100)

A.control;B.pshRNA-Scramble;C.pshRNA-COL1A1

圖3 MTT法檢測3組細(xì)胞的黏附能力Fig 3 Effect of shRNA targeting COL1A1 on the ability of adhesion by MTT

2.4 特異性pshRNA-COL1A1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外遷移能力的影響

pshRNA-COL1A1組穿膜細(xì)胞數(shù)為(325±13)個(gè)，顯著少于control組和pshRNA-scramble組的穿膜細(xì)胞數(shù)(701±21)個(gè)和(667±18)個(gè)(P＜0.001)(圖4)。

2.5 特異性pshRNA-COL1A1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲力的影響

pshRNA-COL1A1組細(xì)胞侵襲Matrigel膠的穿膜細(xì)胞數(shù)為(106±8)個(gè)，顯著少于 control組和pshRNA-scramble組的穿膜細(xì)胞數(shù)(204±13)個(gè)和(187±9)個(gè)(P＜0.001)(圖5)。

3 討論

遷移和侵襲表型的獲得是腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，也是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過程，與腫瘤患者病情的發(fā)展和預(yù)后有密切的關(guān)系［6］。COL1A1基因全長17 537 bp，含有51個(gè)外顯子，位于染色體17q21.33，編碼Ⅰ型膠原纖維的前α1鏈，是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix)的重要組成成分，對(duì)細(xì)胞的黏附、分化有重要作用［7］。已有證據(jù)表明，Ⅰ型膠原可以通過誘導(dǎo)E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附復(fù)合物解聚及β-鏈蛋白的核轉(zhuǎn)位而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散及增殖［8］。另有報(bào)道，COL1A1-shRNA 轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞能有效抑制細(xì)胞COL1A1的表達(dá)及癌細(xì)胞的增殖遷移［9］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中也存在COL1A1基因的異常表達(dá)［1－2］，且可能與腫瘤的預(yù)后有關(guān)［10］，但COL1A1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞轉(zhuǎn)移的影響目前知之甚少。為此，本研究首先構(gòu)建COL1A1基因的2個(gè)RNA干擾載體，通過轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)2種干擾載體的MDA-MB-231細(xì)胞系，并篩選出抑制 MDA-MB-231細(xì)胞中COL1A1蛋白表達(dá)最明顯的干擾載體。

本研究發(fā)現(xiàn)，pshRNA-COL1A1轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞遷移能力下降，說明本研究構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體不僅能夠在細(xì)胞內(nèi)抑制COL1A1基因表達(dá)，減少Ⅰ型膠原的合成，而且能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖遷移;而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較則無明顯差異，因此可以排除質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染所用試劑本身對(duì)基因的抑制作用。這些結(jié)果也進(jìn)一步說明Ⅰ型膠原可能在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

結(jié)合本研究結(jié)果，從多方面證明了COL1A1基因表達(dá)下調(diào)可有效降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的運(yùn)動(dòng)侵襲能力，為進(jìn)一步深入闡明乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、加深對(duì)COL1A1基因功能的了解以及為研究乳腺癌基因治療的可能性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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