神經(jīng)斷離處移植間充質(zhì)祖細胞延緩骨骼肌萎縮

趙文勇，萬立華*，粟永萍，冉新澤

(1.重慶醫(yī)科大學法醫(yī)學教研室，重慶400016;2.第三軍醫(yī)大學全軍復合傷研究所，重慶400038)

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞體外能分化為神經(jīng)元，移植于受損的神經(jīng)內(nèi)可有效延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮［1－2］，然而足量的神經(jīng)干細胞獲得途徑相對有限且擴增較困難，尋找新的移植細胞極為重要［3］。新近研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)祖細胞(mesenchymal progenitor cell，MPC)可體外誘導分化為神經(jīng)元樣細胞［4］，且具有易獲取、易生長、增殖能力強等特點，可望成為神經(jīng)干細胞的替代種子細胞［5］。既然MPC體外誘導可以分化為神經(jīng)元樣細胞，那么將其移植于神經(jīng)離斷處能否延緩失神經(jīng)肌肉萎縮呢?目前鮮見報道?；诖吮狙芯窟M行了相關(guān)探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠6只，雌性，清潔級，3周齡，體質(zhì)量(10±1)g;C57小鼠36只，雄性，清潔級，12周齡，體質(zhì)量(20±1)g;由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學動物中心提供。動物使用許可證:SCXK(渝)2007-0004;環(huán)境許可證:XYXK(渝)2007-0004。

1.2 主要試劑

兔抗鼠 α-actin、MHC、GAPDH抗體及羊抗兔IgG/TRITC二抗(Sigma公司);蛋白提取液(Pierce公司);RNAiso Reagent、RNA PCR Kit(AMV)ver.3.0(TaKaRa公司);肌細胞生成素擴增引物為5'-TGG AGCTGTATGAGACATCCC-3'，5'-TGGACAATGCTCAG GGGTCCC-3'，磷酸甘油醛脫氫酶擴增引物為5'-ACC ACAGTCCATGCCATCAC-3'，5'-TCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'，MyoD 擴增引物為:5'-GCCCGCGCTCCA ACTGCTCTGAT-3'，5'-TCTTTTGGGCGTGAAGAACCA G-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 MPC的分離、培養(yǎng)及鑒定

取GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠后肢長骨，MPC的分離、培養(yǎng)及鑒定方法參見文獻［4］。

1.4 小鼠腓腸肌失神經(jīng)支配模型的制備

C57小鼠隨機分為MPC移植組、神經(jīng)斷離組及對照組，每組12只。小鼠腓腸肌失神經(jīng)支配模型制備方法參照文獻［6］;對照組不作任何處理。術(shù)后2和4周，每組隨即取6只小鼠斷頸處死并提取雙側(cè)小腿腓腸肌作實驗觀察。

1.5 MPC體內(nèi)移植

選取第3代MPC用PBS調(diào)整細胞濃度至5×105個/μL。5 μL緩慢注于 MPC 移植組神經(jīng)斷離處，神經(jīng)斷離組同法注入等量PBS;對照組不作任何處理。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況:觀察小鼠后肢活動能力情況。

1.6.2 MPC移植存活情況:切取MPC注射部位周圍肌肉行組織冰凍切片，利用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠體細胞自發(fā)綠色熒光的特點，熒光顯微鏡下觀察移植細胞存活情況。

1.6.3 腓腸肌濕重維持率測定:完整取下左右側(cè)腓腸肌稱重，右側(cè)除以左側(cè)，計算腓腸肌濕重維持率。

1.6.4 肌纖維橫截面積維持率的測定:取小鼠雙側(cè)后肢腓腸肌中份肌腹行組織冰凍切片，HE染色，采用VDSⅢ型半自動圖像分析儀(A．M．S公司)測量肌纖維橫截面積(cross section area，CSA)，右側(cè)除以左側(cè)，計算其維持率。

1.6.5 超微結(jié)構(gòu)觀察:右后肢腓腸肌中份肌腹切取少量組織進行超薄切片，用JEM-12OOEX透射電鏡觀察退變的肌細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌絲肌節(jié)的形態(tài)及膠原纖維的變化。

1.6.6 Western blot檢測 α-actain、MHC 的表達:參照說明書提取肌肉總蛋白質(zhì)，經(jīng)過電泳、半干法電轉(zhuǎn)膜及封閉后，兔抗鼠α-actain/MHC、羊抗兔IgG分別與膜37℃溫育，間以洗膜，終以化學發(fā)光試劑盒顯影、定影及攝片，最后在凝膠成像系統(tǒng)下分析處理，灰度掃描進行半定量分析。

1.7 RT-PCR檢測Myogenin、MyoD的基因表達

參照說明書提取肌肉總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，常規(guī)方法進行PCR及凝膠電泳，最后在紫外透射儀下掃描圖像，采用Quantity one圖像分析軟件進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

隨著治療時間的延長，MPC移植組小鼠右后肢活動能力逐漸接近正常。

2.2 MPC體內(nèi)移植存活情況

MPC注射部位周圍肌肉見發(fā)綠色熒光的細胞均勻分布于肌細胞間隙(圖1A);神經(jīng)斷離組肌內(nèi)未見確切發(fā)綠色熒光的細胞(圖1B)。

2.3 肌肉濕重及橫截面積維持率變化

術(shù)后2和4周，MPC移植組小鼠腓腸肌濕重、肌纖維橫截面積維持率均顯著高于神經(jīng)斷離組(n=6)(圖2)。

2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

術(shù)后4周，與神經(jīng)斷離組比較，MPC移植組細胞核明顯增大、核質(zhì)染色均勻，異染色質(zhì)發(fā)達;線粒體數(shù)量增多，腫脹不明顯，線粒體脊較多，形狀相對正常;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張少;肌絲肌節(jié)排列整齊，無明顯的融合;肌纖維間隙膠原纖維量少 (圖3)。

2.5 肌動蛋白和肌球蛋白的表達

術(shù)后4周，MPC移植組肌動蛋白、肌球蛋白的表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組和對照組(n=6)(圖4)。

圖3 腓腸肌超微結(jié)構(gòu)變化Fig 3 Changes of morphology of gastrocnemius

圖4 腓腸肌α-actin、MHC的表達Fig 4 Expression of α-actin，MHC of gastrocnemius

2.6 RT-PCR檢測Myogenin、MyoD基因表達

術(shù)后4周，MPC移植組MyoD的基因表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組及對照組，Myogenin基因表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組;對照組未發(fā)現(xiàn)明顯Myogenin基因表達(n=6)(圖5)。

3 討論

圖5 腓腸肌Myogenin、MHC的表達Fig 5 Expression of Myogenin and MHC of gastrocnemius

由于神經(jīng)干細胞獲得途徑有限且擴增困難，尋找新的移植細胞至關(guān)重要。盡管間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能、來源廣泛、取材方便、危險性低、無免疫排斥反應(yīng)及體外可定向分化為神經(jīng)元樣細胞［7－9］等特點，然而體外培養(yǎng)小鼠MPC時卻極易受到造血干細胞的污染而使增殖效果不理想［10］，其用來肌內(nèi)移植治療失神經(jīng)性骨骼肌萎縮難免受到造血干細胞的干擾。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MPC同樣具有BMSCs的特點，由于其來源于密質(zhì)骨，體外培養(yǎng)時可避免造血干細胞的污染，不失為神經(jīng)干細胞的可選種子細胞［11］。那將MPC移植于神經(jīng)斷離處能否定植存活并發(fā)揮延緩骨骼肌萎縮的作用呢?

研究發(fā)現(xiàn)，隨著治療時間的延長，MPC移植組小鼠右后肢活動能力逐漸恢復正常，移植細胞能夠定植存活并均勻分布于肌細胞間隙，肌絲肌節(jié)排列整齊且肌細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的退變及肌肉纖維化的程度明顯優(yōu)于神經(jīng)斷離組，肌肉濕重、肌纖維橫截面積維持率的下降幅度及α-actin、MHC的降解速度顯著低于神經(jīng)斷離組，這表明MPC神經(jīng)斷離處移植可有效延緩骨骼肌萎縮。

研究表明，MyoD是成肌分化的決定因子，新生和再生的骨骼肌衛(wèi)星細胞含有高水平的MyoD蛋白，骨骼肌再生時，肌衛(wèi)星細胞激活早期表達MyoD，隨后所有增生肌衛(wèi)星細胞均表達 MyoD，因此，MyoD被視為肌衛(wèi)星細胞激活的一個標記蛋白［12］。大量動物實驗發(fā)現(xiàn):成體骨骼肌一旦失神經(jīng)支配，Myogenin表達上調(diào)，繼而啟動一系列骨骼肌特異的胚胎性受體和收縮蛋白的合成，而這些胚胎性蛋白的表達是失神經(jīng)骨骼肌接受神經(jīng)再支配的必要前提［13］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周，MPC移植組MyoD表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組及對照組，Myogenin基因表達強度顯著高于神經(jīng)斷離組。因此，推測延緩骨骼肌萎縮的可能機制是:定植存活的MPC分泌了某些營養(yǎng)因子，通過軸突運輸?shù)竭_腓腸肌，導致被激活的肌衛(wèi)星細胞成肌分化產(chǎn)生大量的新生肌纖維抑或直接抑制了肌細胞的萎縮，最終肌肉濕重、肌肉蛋白含量及肌纖維橫截面積得以維持，但其具體作用機制有待進一步實驗研究。

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