唐氏綜合征胎兒全基因組miRNA表達(dá)譜特征及其染色體分布

李武縣，梁勤東，董晉豫，王 秦，戴 勇，2，涂植光，徐 勇，3*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)教育部臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016;2.深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東深圳518020;3.深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東深圳518118)

唐氏綜合征(Down syndrome，DS)，又名21-三體綜合征，常伴有智力低下、特殊面容、免疫缺陷等80多種臨床癥狀［1－2］。關(guān)于DS患者各臨床癥狀的產(chǎn)生，大部分研究學(xué)者認(rèn)為是21號(hào)染色體和2倍體基因表達(dá)紊亂的共同作用結(jié)果［3］。而21號(hào)3染色體基因如何導(dǎo)致2倍體基因表達(dá)紊亂、擾亂正常發(fā)育，產(chǎn)生各種臨床有害表型的機(jī)制仍不清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)小的、長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸(nucleotides，nt)的內(nèi)生性單鏈非編碼RNA。他們可與其靶基因mRNA的3'-端特異性結(jié)合，使靶基因mRNA降解或抑制靶基因編碼蛋白的表達(dá)，在基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控中具有重要作用，是一種有效的基因表達(dá)調(diào)控因子［4］。已有研究證明21號(hào)染色體miRNA基因的過(guò)表達(dá)與DS相關(guān)臨床表型的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［2］。因此，鑒別與DS各臨床表型相關(guān)miRNA的表達(dá)譜和染色體分布特征，將有助于了解DS疾病臨床表型發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究DS患者全基因組基因表達(dá)紊亂及其與相關(guān)臨床癥狀的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)?zāi)殠а獦?biāo)本由深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心遺傳室提供，標(biāo)準(zhǔn)型DS胎兒臍帶血6例(2男性，4女性)，正常胎兒臍帶血6例(2男性，4女性)，分別設(shè)為DS組和對(duì)照組。每例樣本均由常規(guī)G顯帶染色體核型分析確診，孕周18～22周，孕婦年齡30～44歲。該研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且征得所有孕婦知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本的處理:按照單個(gè)核細(xì)胞提取標(biāo)準(zhǔn)步驟，運(yùn)用淋巴細(xì)胞分離液(Invitrogen公司)提取1 mL EDTA抗凝臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，溶入1 mL Trizol試劑(Invitrogen公司)混合均勻，置于凍存管中，凍存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取:將凍存樣本常溫下解凍，按照Trizol試劑盒(Invitrogen公司)操作說(shuō)明提取總RNA。經(jīng)Agilent 2000 Bioanalyzer分析儀檢測(cè)合格后(RIN≥8.0且28 S/18 S＞1.5)，用于 small RNA建庫(kù)Illumina測(cè)序分析。

1.2.3 Small RNA文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序:分別等量混合DS組和對(duì)照組胎兒臍帶血單個(gè)核細(xì)胞RNA(總量≥10 μg)，構(gòu)建small RNA文庫(kù)。先用15%PAGE電泳分離混合RNA樣本，回收純化18～30 nt長(zhǎng)的small RNA分子。在T4 RNA連接酶作用下，給small RNAs分子加上3'adaptor和5'adaptor，再由RT-PCR擴(kuò)增生成 small RNA文庫(kù)，運(yùn)用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序儀進(jìn)行深度測(cè)序分析。文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序均在深圳華大基因研究院的協(xié)助下完成。

1.2.4 Small RNA數(shù)據(jù)處理和注釋:首先對(duì)Illumina測(cè)序所得序列進(jìn)行去adaptor、去低質(zhì)量、去污染、去冗余等處理，獲得高質(zhì)量干凈序列并進(jìn)行長(zhǎng)度分布分析;再運(yùn)用SOAP(2.0)軟件將高質(zhì)量干凈序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)［repeatmarker、genbank、rfam(10.0)、UCSC和piRNA數(shù)據(jù)庫(kù)］進(jìn)行序列比對(duì)分類(lèi)注釋(堿基錯(cuò)配 ≤2)，盡可能去除重復(fù)序列，rRNA，tRNA，mRNA降解片段，scRNA、snoRNA、snRNA、piRNA 等非編碼RNA序列;再將余下序列與miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase17.0)中人miRNA序列比對(duì)，獲取兩組樣本已知miRNA的含量、表達(dá)豐度和染色體分布等信息。

1.2.5 兩樣本miRNA表達(dá)差異比較:首先對(duì)兩組樣本表達(dá)miRNA作歸一化處理，使每個(gè)miRNA的表達(dá)量處于同一個(gè)量級(jí)［公式:歸一化表達(dá)量(TPM)=miRNA表達(dá)量/樣品總表達(dá)量×106］;再利用Audic and Claverie test統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較兩組樣本miRNA的表達(dá)差異，并計(jì)算P值［5］。若miRNA在兩組樣本間的倍比值≥2且P＜0.001，則認(rèn)為該miRNA在兩組樣本間的表達(dá)差異顯著;若miRNA歸一化后在兩組樣本中的表達(dá)量都小于10 TPM，則該miRNA不參與差異表達(dá)分析。

1.2.6 兩樣本miRNA染色體分布:為研究?jī)山M樣本表達(dá)miRNA編碼基因的染色體分布，根據(jù)miRBase17.0(http://www．mirbase．org/)人類(lèi) miRNA注釋基因，作如下處理:1)對(duì)miRNA基因表達(dá)產(chǎn)物作如上歸一化處理，使兩組樣本miRNA基因表達(dá)水平處于同一量級(jí);2)篩除多染色體多位點(diǎn)miRNA編碼基因;3)若一個(gè)miRNA基因在兩組樣本中同時(shí)表達(dá)成熟體miRNA和miRNA*(miRNA*:miRNA功能單鏈的互補(bǔ)鏈)，或miRNA-5p和miRNA-3p(新的miRNA命名，分別位于同一miRNA基因的5'和3'端)，則取兩者較高值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 Stem-loop qRT-PCR驗(yàn)證:提取各樣本總RNA等量混合，用含 miRNA特異莖環(huán)引物的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)合成cDNA，反應(yīng)條件為85℃ 5 min、42℃ 60 min、85℃ 10 min。real-time PCR反應(yīng)采用SYBR green real-time PCR Kit(TOYOBO)在ABI PRISM? 7500 PCR儀上進(jìn)行。以U6為內(nèi)參，95℃預(yù)反應(yīng)5 min后，在94℃15 s、60℃ 15 s、72℃ 32 s條件下，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。檢測(cè)結(jié)果采用2－△△Ct法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 兩樣本small RNA數(shù)據(jù)處理和注釋

DS組和對(duì)照組分別獲得高質(zhì)量干凈序列21 770 729(P)和17 482 100(N)條，主要分布在22 nt長(zhǎng)度周?chē)?。其中分別有8 087 250(P)和12 536 630(N)條序列與全基因組匹配，分類(lèi)注釋(圖1)。兩組樣本表達(dá)miRNA/miRNA*序列共有395種編碼于 316個(gè) miRNA基因，其中 DS組miRNA表達(dá)序列243種(218種 miRNA和25種miRNA*)，共計(jì)2 208 096條(約占 28%);對(duì)照組miRNA表達(dá)序列349種(295種miRNA和54種miRNA*)，共計(jì)6 369 123條(約占51%)。在兩組樣本中都有表達(dá)的miRNA和miRNA*序列分別有178種和19種。

2.2 兩樣本miRNA表達(dá)譜的差異

圖1 Small RNA匹配序列在兩組樣本中所占的比例Fig 1 The percentage of matched small RNA sequence tags in both groups

兩組樣本顯著差異表達(dá)的miRNA共有149種(表1)，其中有6種在DS組中表達(dá)上調(diào)，143種表達(dá)下調(diào)。此外，有51種miRNA特異性表達(dá)于對(duì)照組(表2)。21號(hào)染色體已注釋的14個(gè)miRNA基因，除 let-7c、miR-99a、miR-125b 和 miR-155 在 DS組中低表達(dá)外，其余10個(gè)21號(hào)染色體miRNA基因在兩組中均未表達(dá)。Stem-loop qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)(圖2)。

2.3 兩樣本miRNA的染色體分布

兩樣本表達(dá)miRNA編碼基因的染色體分布見(jiàn)(圖3)。兩樣本miRNA基因的表達(dá)豐度染色體分布如(圖4)。

表1 歸一化后表達(dá)量大于1000 TPM的差異表達(dá)miRNA/miRNA*Table 1 The differentially expressed miRNA/miRNA*with the normalized expression level＞1000 TPM in two groups

表2 51個(gè)特異表達(dá)于對(duì)照組樣本的miRNA/miRNA*Table 2 51 miRNA/miRNA*are specially expressed in the control group

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，其編碼基因主要位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子或基因間區(qū)，有的miRNA還有其獨(dú)立的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，可獨(dú)立完成自身的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，其表達(dá)具有時(shí)間和組織特異性［6－7］。到目前為止，在 miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù) miRBase(release17.0)中已注釋人miRNA基因有1 283個(gè)，可編碼1 733種miRNA/miRNA*成熟序列，其中有14個(gè)miRNA編碼基因位于21號(hào)染色體上。已有研究證明21號(hào)染色體上 5種miRNA(let-7c，miR-125b，miR-155，miR-802 和miR-99a)在DS胎兒腦和心臟組織中均高表達(dá)，超過(guò)1.5倍［8］，在DS患者智力低下、免疫缺陷等臨床癥狀的形成過(guò)程中具有重要作用［2］。在本實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組相比，表達(dá)的21號(hào)染色體miRNA編碼基因除miR-802外，其余4個(gè)miRNA 基因(let-7c、miR-125b、miR-155 和 miR-99a)并未出現(xiàn)理論中的1.5倍以上升高，反而表達(dá)降低。此種現(xiàn)象也存在于DS患者其他組織細(xì)胞關(guān)于21號(hào)染色體基因差異表達(dá)的研究中［9］，說(shuō)明miRNA基因的表達(dá)具有其時(shí)間和組織特異性。此外，對(duì)miR-802在Illumina測(cè)序中未檢測(cè)到，可能與Illumina測(cè)序small RNA建庫(kù)過(guò)程中反轉(zhuǎn)錄引物的特異性較低有關(guān)，這與文獻(xiàn)［8］的芯片研究結(jié)果一致。

miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要有“基因轉(zhuǎn)錄沉默(transcriptional gene silencing，TGS)”和“轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)”兩種途徑［6］。以往關(guān)于DS患者全基因組基因和蛋白表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)大部分基因及蛋白在DS患者中均高表達(dá)［3，10］。通過(guò)生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究證明［4］，miRNA與其靶基因的表達(dá)之間存在一種負(fù)向調(diào)控關(guān)系，一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)mRNA的表達(dá)。

圖4 兩組樣本miRNA表達(dá)豐度的染色體分布Fig 4 The chromosome distribution of miRNA expression abundance in both groups

在本實(shí)驗(yàn)中，大部分miRNA分子在DS患者中均低表達(dá)。通過(guò)TGS途徑，miRNA的低表達(dá)可促進(jìn)其靶基因的表達(dá)和翻譯，進(jìn)而提高蛋白表達(dá)水平。這在一定程度上解釋了為什么DS患者全基因組基因和蛋白表達(dá)會(huì)升高以及21號(hào)3染色體導(dǎo)致2倍染色體基因表達(dá)紊亂的原因。通過(guò)對(duì)兩組樣本所測(cè)miRNA基因及其表達(dá)豐度的染色體分布研究，發(fā)現(xiàn)表達(dá)miRNA編碼基因在兩樣本染色體上的分布趨于一致，但其表達(dá)豐度在染色體上的分布卻明顯不同:DS組主要分布于8、16、17和21號(hào)染色體，而對(duì)照組主要分布于3、8、14、16、17和22號(hào)染色體。提示這些2倍染色體基因編碼的miRNA可能在DS患者各有害臨床性狀的形成過(guò)程中具有重要作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Illumina深度測(cè)序技術(shù)對(duì)DS胎兒全基因組miRNA表達(dá)譜和染色體分布特征的研究，初步探討了miRNA與DS全基因組基因表達(dá)紊亂之間的關(guān)系;差異顯著和特異表達(dá)的miRNA分子可作為DS胎兒潛在的產(chǎn)前篩查診斷指標(biāo)。但關(guān)于miRNA、基因和蛋白之間在DS患者中的相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及與DS患者有害臨床性狀的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

［1］Sommer CA，Henrique-Silva F．Trisomy 21 and Down syndrome:a short review［J］．Braz J Biol，2008，68:447 －452．

［2］Elton TS，Sansom SE，Martin MM．Trisomy-21 gene dosage over-expression of miRNAs results in the haploinsufficiency of specific target proteins［J］．RNA Biol，2010，7:540 －547．

［3］Patterson D．Molecular genetic analysis of Down syndrome［J］．Human Genetics，2009，126:195 －214．

［4］ Satoh JI，Tabunoki H．Comprehensive analysis of human microRNA target networks［J］．BioData Min，2011，4:17－26．

［5］Audic S，Claverie JM．The significance of digital gene expression profiles［J］．Genome Res，1997，7:986 －995．

［6］Rearick D，Prakash A，McSweeny A，et al．Critical association of ncRNA with introns［J］．Nucleic Acids Res，2011，39:2357－2366．

［7］Siomi H，Siomi MC．Posttranscriptional regulation of microRNA biogenesis in animals［J］．Mol Cell，2010，38:323－332．

［8］Kuhn DE，Nuovo GJ，Martin MM，et al．Human chromosome 21-derived miRNAs are overexpressed in down syndrome brains and hearts［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，370:473－477．

［9］Sommer CA，Pavarino-Bertelli EC，Goloni-Bertollo EM，et al．Identif;%96%94ication of dysregulated genes in lymphocytes from children with Down syndrome［J］．Genome，2008，51:19－29．

［10］Wang TH，Chao AS，Chen JK，et al．Network analyses of differentially expressed proteins in amniotic fluid supernatant associated with abnormal human karyotypes［J］．Fertil Steril，2009，92:96 －107．