普伐他汀減輕大鼠急性心肌梗死后瞬時外向鉀電流的表達(dá)

楊海燕，佘 強(qiáng)，張玉方

(1.重慶市第三人民醫(yī)院老年心血管科，重慶400014;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶400016;3.重慶市江北區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，重慶400020)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心肌細(xì)胞膜離子通道的異?；顒?，形成電重構(gòu)，可能是導(dǎo)致AMI后出現(xiàn)心律失常的原因?？剐穆墒СＫ幬锏膽?yīng)用減少了心律失常的發(fā)生，但同時又有致心律失常的潛在風(fēng)險，這就需要新的更安全的抗心律失常藥物。他汀類藥物目前研究較多，它具有抗心律失常作用［1］，尚未見報道其有致心律失常的作用，但其抗心律失常的機(jī)制尚不明確。瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)在心肌動作電位的快速復(fù)極I期中起重要作用，目前認(rèn)為大鼠Ito主要由Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3編碼;研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠AMI后，心室肌細(xì)胞Ito電流密度下降［2］，但尚無各時間點(diǎn)對比的報道。本研究觀察大鼠AMI模型不同時間點(diǎn)Ito各基因表達(dá)的變化，及普伐他汀對AMI后Ito表達(dá)的影響，為AMI后心律失常的藥物治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組

1.1.1 大鼠AMI模型的建立:SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心［SCXK(渝)2007-0001］提供，采用常規(guī)方法建立大鼠AMI模型［3］，假手術(shù)大鼠為前降支只穿線不打結(jié)。取成功手術(shù)大鼠20只，隨機(jī)分為4組，每組5只。其中4組分別為手術(shù)后24 h組、手術(shù)后1周組、手術(shù)后4周組、手術(shù)后4周加普伐他汀治療組(20 mg/kg每天灌胃1次，藥物購自上海三共制藥有限公司)及假手術(shù)組。后者15只，在前述3個時間點(diǎn)取心臟標(biāo)本，每組5只。除普伐他汀組外其余各組均以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.1.2 采集心臟標(biāo)本:在10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉下迅速處死大鼠，取右室游離壁，在0.9%氯化鈉及0.1%DEPC水中清洗，置于液氮中保存。

1.2 Real-time PCR法檢測Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA

1.2.1 引物設(shè)計:使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物。kv1.4上游引物5'-GAATGACACCT CGGCACCC-3'，下游引物 5'-AAACTCAAAGGAAAA CCACACG-3'，長度106 bp;kv4.2上游引物5'-CTT CTGCTTGGATACCGCC-3'，下游引物5'-AGCCCAAT GTAATAGGGTAGGAT-3'，長度144 bp;Kv4.3 上游引物 5'-TGCCTGGGAGCAAGGAACT-3'，下游引物5'-CACTGCGGATGAAGCGGTA-3'， 長 度 144 bp。β-actin上游引物 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，長度150 bp。

1.2.2 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA相對表達(dá)量的檢測:取右室心肌組織50～100 mg，采用Trizol試劑提取總RNA，取5 μL RNA模板行反轉(zhuǎn)錄成cDNA(反應(yīng)條件:25℃ 10 min，40℃ 60 min，70℃ 10 min)。擴(kuò)增目的基因和管家基因(反應(yīng)參數(shù):93℃ 2 min，93 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 cycles)，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，按照ShineSYBR Real time qPCR Mastermix試劑盒(上海閃晶生物公司)說明書進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增目的基因和管家基因，擴(kuò)增條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)。根據(jù)Ct值讀出起始模板量后計算出目的基因的相對拷貝數(shù)。

1.3 Westernblot法檢測 Kv1.4、Kv4.2及 Kv4.3蛋白

取右室心肌組織約100 mg，按100 mg/mL加入RIPA全蛋白提取液(上海申能博彩公司)，加入10 μL PMSF，冰上勻漿30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液20 μL BCA測定蛋白濃度。其余上清液加入等量2×上樣緩沖液，于70℃加熱10 min，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h，加入一抗(兔抗大鼠 Kv1.4、Kv4.3和 Kv4.2，0.8 mg/mL)，37℃、60 r/min搖動90 min，棄去一抗，用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌3次，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，1∶1 000)37℃孵育1 h，棄去二抗，再用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌3次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)分析條帶吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA的表達(dá)

假手術(shù)組各時間點(diǎn)右室心肌Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯差異。AMI后24 h，Kv1.4 mRNA表達(dá)開始增高，1周組、4周組與24 h組比較無明顯差異;Kv4.2 mRNA表達(dá)在AMI后24 h開始降低，4周組更低，1周組較24 h組比較無明顯差異;Kv4.3 mRNA表達(dá)在AMI后各時間點(diǎn)均降低，24 h組最低，1周組與4周組比較無明顯差異，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 各組mRNA表達(dá)水平Table 1 mRNA expression of each group(n=5)

2.2 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3蛋白質(zhì)的表達(dá)

Kv1.4蛋白質(zhì)表達(dá)在AMI后24 h開始增高，1周組、4周組與24 h組比較無明顯差異，普伐他汀組與4周組比較表達(dá)降低;而Kv4.2及Kv4.3蛋白質(zhì)在AMI后24 h開始降低，具體數(shù)據(jù)見表2，圖1。

表2 各組蛋白質(zhì)表達(dá)水平Table 2 Protein expression of each group(n=5)

2.3 普伐他汀組與 4周組 Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較

普伐他汀組Kv1.4 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平較4周組降低，而Kv4.2、Kv4.3 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平較4周組增高，具體數(shù)據(jù)見表1，表2及圖1。

圖1 各組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3蛋白質(zhì)表達(dá)Fig 1 Protein expression changes of Kv1.4，Kv4.2，Kv4.3

3 討論

Ito是控制心室肌細(xì)胞動作電位時程的主要電流［4］。Ito有兩種成分:慢成分(Kv1.4基因編碼)及快成分(Kv4.2、Kv4.3基因編碼)兩種。Ito在心臟中的分布具有明顯的組織特異性，心尖部大于基底部，心外膜大于心內(nèi)膜，研究發(fā)現(xiàn)藥物對Ito影響程度也和組織分布有關(guān)［5－6］。本研究選用大鼠右室心肌，其原因是在左室AMI后，右室代償功能起著重要作用，也同樣存在基因表達(dá)的變化，右室相對遠(yuǎn)離梗死區(qū)域，可以避免取材時組織缺血本身對Ito表達(dá)的影響，而且右室游離壁壁薄，量相對較少，檢測時使用了全部右室標(biāo)本，避免了Ito組織特異性分布對結(jié)果的影響。

AMI后心肌細(xì)胞的丟失引起心室重構(gòu)，Ito電流下降，心肌細(xì)胞復(fù)極不均一，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生［7］。研究發(fā)現(xiàn)犬及大鼠 AMI后 Ito電流密度下降，Kv1.4表達(dá)增高，而 Kv4.2及 Kv4.3表達(dá)降低［8－9］，但未見 AMI后各時間點(diǎn)變化趨勢的報道。本文報道了大鼠AMI后 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3表達(dá)的變化趨勢，為AMI后Ito研究的時間點(diǎn)選取提供依據(jù)。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平及AngⅡ1型受體、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血漿游離脂肪酸的變化可以影響Ito的表達(dá)［10－11］，目前認(rèn)為 AMI后 Ito表達(dá)變化的機(jī)制可能與AMI后循環(huán)及心肌局部AngⅡ增高及TNF表達(dá)增加所致。

他汀類藥物能抑制心肌梗死后心肌局部AngⅡ產(chǎn)生，使AngⅡ1型受體活性下調(diào)，抑制TNF的表達(dá)及抗心律失常等作用，抗心律失常的機(jī)制尚不明確。有報道阿托伐他汀可阻止Ito在單純?nèi)毖獣r持續(xù)減小的趨勢［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，普伐他汀能抑制 AMI后Kv1.4表達(dá)增高及Kv4.2、Kv4.3表達(dá)降低，其機(jī)制可能是他汀類藥物抑制心肌局部AngⅡ產(chǎn)生、下調(diào)AngⅡ1型受體活性、抑制TNF的表達(dá)使Kv4.3及Kv4.2 mRNA表達(dá)增加，從而反轉(zhuǎn)AMI后心肌細(xì)胞Ito的減少，減少AMI后復(fù)極不均一性，發(fā)揮AMI后抗心律失常的作用，但本實(shí)驗(yàn)未同時進(jìn)行心肌局部AngⅡ、AngⅡ1型受體活性及TNF的表達(dá)的檢測，其機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Vedre A，Gurm H，F(xiàn)roehlich J，et al．Impact of prior statin therapy on arrhythmic events in patients with acute coronary syndromes(from the Global Registry of Acute Coronary Events［GRACE］)［J］．Am J Cardiol，2009，104:1613 －1617．

［2］Wen D，Penelope A，Boyden．Diverse phenotypes of outward currents in cells that have survived in the 5-day-infarcted heart［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289:667－673．

［3］劉開宇，田海，孫露，等．標(biāo)準(zhǔn)化大鼠心肌梗死模型的制作［J］．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，41:531－534．

［4］Scholz E，Welke F，Joss N，et al．Central role of PKCα in isoenzyme-selective regulation of cardiac transient outward current Ito and Kv4．3 channels［J］．J Mol Cell Cardiol，2011，51:722 －729．

［5］Calloe K，Nof E，Jespersen T，et al．Comparison of the effects of a transient outward potassium channel activator on currents recorded from atrial and ventricular cardiomyocytes［J］．J Cardiovasc Electrophysiol，2011，22:1057 －1066．

［6］Su F，Shi M，Yan Z，et al．Simvastatin modulates remodeling of Kv4．3 expression in rat hypertrophied cardiomyocytes［J］．Int J Biol Sci，2012，8:236 － 248．

［7］Zhang L，Xu C，Hong Y，et al．Propranolol regulates cardiac transient outward potassium channel in rat myocardium via cAMP/PKA after short-term but not after long-term ischemia［J］．NaunynScmied Arch Pharmacol，2010，382:63－71．

［8］Wen Dun，Penelope A．Boyden．Diverse phenotypes of outward currents in cells that have survived in the 5-day-infarcted heart［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289:667－673．

［9］Wickenden，Alan D，Roger Kaprielian，et al．The thyroid hormone analog DITPA restores Ito in rats after myocardial infarction［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，278:1105－1116．

［10］Ozgen N，Lu Z，Boink GJ，et al．Microtubules and angiotensinⅡreceptors contribute to modulation of repolarization induced by ventricular pacing［J］．Heart Rhythm，2012，11:1865 －1872．

［11］向玉鸞，何莉，余強(qiáng)．鹽酸曲美他嗪對大鼠缺血心室肌Ito通道儀亞單位表達(dá)影響的研究［J］．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，35:1779 －1781．

［12］趙青，李洪仕，萬征，等．阿托伐他汀對大鼠模擬缺血左室瞬時外向鉀電流的作用［J］．中國心臟起搏與心電生理雜志，2011，25:426－430．