軟骨來(lái)源成體干細(xì)胞的分離及其鑒定

左 偉，吳志宏，蘇新林，吳 南，邱貴興

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730)

由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管和神經(jīng)支配，僅含有單一的軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷后自身修復(fù)能力很差。關(guān)節(jié)軟骨損傷最終會(huì)導(dǎo)致軟骨的剝脫，關(guān)節(jié)面不完整，給患者造成關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及活動(dòng)障礙等極大痛苦。目前，軟骨損傷的修復(fù)已成為骨科醫(yī)生的一項(xiàng)挑戰(zhàn)，組織工程學(xué)的提出為軟骨缺損的修復(fù)重建提供了新的治療途徑，但如何獲得適合的種子細(xì)胞是軟骨組織工程的關(guān)鍵。除了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，近年來(lái)已有學(xué)者從人的脂肪、皮膚、滑膜甚至椎間盤組織中分離出成體干細(xì)胞［1－4］，但關(guān)于軟骨來(lái)源成體干細(xì)胞的研究還比較少，本研究旨在觀察關(guān)節(jié)軟骨中是否存在有軟骨干細(xì)胞，并對(duì)軟骨干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，以期為將來(lái)的組織工程學(xué)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hycolon公司);成脂肪、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(R＆D公司);纖連蛋白，油紅O，茜素紅和甲苯胺藍(lán)(Sigma公司);CD45，CD90，CD73等流式檢測(cè)抗體(BD公司);堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(碧云天公司);Ⅱ型膠原和蛋白多糖(Aggrecan)抗體(Abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 軟骨干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):選擇2011年10月至2012年4月在北京協(xié)和醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)表面置換手術(shù)的晚期骨關(guān)節(jié)炎患者6例，其中男性2例，女性4例，年齡63.2±3.5歲。經(jīng)患者同意、醫(yī)院倫理委員會(huì)許可，收集手術(shù)后廢棄的軟骨組織，用剪刀將軟骨剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶，37℃水浴搖床消化8 h后，70μm濾網(wǎng)過(guò)濾得到單個(gè)軟骨細(xì)胞。將軟骨細(xì)胞以4×103個(gè)/mL的密度接種至預(yù)先用10μg/mL纖連蛋白處理過(guò)的平皿中，20 mins后給予換液以去除未貼壁的細(xì)胞，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。兩周后，用克隆環(huán)挑取平皿中所形成細(xì)胞數(shù)大于32的單個(gè)集落，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，具體方法可參考文獻(xiàn)［5］。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè):取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代軟骨干細(xì)胞，胰蛋白酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每檢測(cè)樣本細(xì)胞量大約為2×105個(gè)。重懸細(xì)胞后加入適當(dāng)濃度的流式檢測(cè)抗體，4℃避光孵育30 mins。PBS洗滌2次后，用300μL PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨干細(xì)胞表面CD分子表達(dá)情況，同時(shí)用PBS作為一抗設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.3 軟骨干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)及鑒定:選擇第3代軟骨干細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后以5×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于12孔板中，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁至90%匯合后改為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每72 h給予換液，同時(shí)設(shè)置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)3周4%多聚甲醛固定后行油紅O染色。

1.2.4 軟骨干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)及鑒定:選擇第3代軟骨干細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后以5×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于12孔板中，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁匯合至80%后改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔72 h給予換液，同時(shí)設(shè)置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)3周4%多聚甲醛固定后行茜素紅染色及堿性磷酸酶活性測(cè)定。

1.2.5 軟骨干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)及鑒定:選取第3代軟骨干細(xì)胞，胰蛋白酶消化后將1×106個(gè)細(xì)胞吸入到15 mL離心管中，經(jīng)離心后形成細(xì)胞微團(tuán)，給予成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每72 h換液1次，同時(shí)設(shè)置普通培養(yǎng)基培養(yǎng)為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)4周后，4%多聚甲醛固定，常規(guī)組織包埋、切片，行甲苯胺藍(lán)染色，并行誘導(dǎo)后組織的Ⅱ型膠原及Aggrecan免疫組化檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果

2.1 軟骨干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

軟骨組織消化后的單個(gè)細(xì)胞接種到纖連蛋白處理過(guò)的平皿20 mins后，部分細(xì)胞即開(kāi)始貼壁。在后期的培養(yǎng)中，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，至2周時(shí)，已有較大集落的形成，部分集落與集落間相互匯合，細(xì)胞呈短梭形。經(jīng)克隆環(huán)挑取細(xì)胞集落繼續(xù)培養(yǎng)后，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，3～4 d即可傳1代。傳至第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形或多角形(圖1)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨干細(xì)胞表面標(biāo)志物

大部分軟骨干細(xì)胞表面表達(dá) CD44、CD29、CD73、CD90和 CD166，但幾乎不表達(dá) CD45、CD34和 CD133(圖2)。

2.3 成脂肪誘導(dǎo)及其鑒定

在成脂誘導(dǎo)過(guò)程中，可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞變大，胞核周圍出現(xiàn)空泡樣小脂滴顆粒，約2周后脂滴增大并相互融合。行油紅O染色，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂滴，而普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組則無(wú)明顯脂滴形成(圖3)。

2.4 成骨誘導(dǎo)及其鑒定

軟骨干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變成多角形，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，細(xì)胞間可見(jiàn)有鈣質(zhì)沉積，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶檢測(cè)也可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá);普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組則無(wú)明顯鈣質(zhì)沉積，堿性磷酸酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)(圖4)。

2.5 成軟骨誘導(dǎo)及其鑒定

細(xì)胞在15 mL離心管經(jīng)離心后48 h，即可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚集成不規(guī)則團(tuán)塊樣，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)組細(xì)胞團(tuán)塊逐漸增大，變成球狀，表面也變得光滑。培養(yǎng)4周后，可見(jiàn)誘導(dǎo)組的軟骨團(tuán)塊大于普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組，誘導(dǎo)后軟骨組織包埋切片，可以發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性，經(jīng)免疫組化檢測(cè)，誘導(dǎo)后的軟骨組織也可表達(dá)Ⅱ型膠原和Aggrecan(圖5)。

3 討論

目前，針對(duì)有癥狀關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)已成為一種趨勢(shì)，軟骨組織工程的提出，為大面積的軟骨缺損修復(fù)提供了新的途徑。理論上，自體軟骨細(xì)胞是構(gòu)建軟骨最為理想的種子細(xì)胞，但人體內(nèi)軟骨細(xì)胞來(lái)源非常有限，且在體外培養(yǎng)過(guò)程中，軟骨細(xì)胞增殖能力較弱，也極易發(fā)生老化及去分化，喪失形成軟骨的能力［6－7］。有學(xué)者以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在體外構(gòu)建組織工程軟骨，但發(fā)現(xiàn)所形成的是一些類軟骨樣組織，其生物學(xué)性能明顯不如正常軟骨［8－9］。本研究試想，如果能從關(guān)節(jié)軟骨中分離、鑒定出軟骨干細(xì)胞，一方面能為軟骨組織工程提供良好的種子細(xì)胞，另一方面也可能為軟骨損傷的原位修復(fù)治療提供新的希望。

圖5 軟骨干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)Fig 5 Chondrogenic differentiation in cartilage-derived stem cells

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)形成單個(gè)集落的特性成功分離出軟骨干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)軟骨干細(xì)胞表面表達(dá) CD44、CD29、CD73、CD90和CD166等分子，且?guī)缀醪槐磉_(dá) CD45、CD34和CD133。在體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，軟骨干細(xì)胞能成功向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞進(jìn)行分化;當(dāng)給與成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，軟骨干細(xì)胞能聚集成團(tuán)，免疫組化結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的組織能成功表達(dá)Ⅱ型膠原及Aggrecan，Ⅱ型膠原和Aggrecan是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的主要成分，這說(shuō)明在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，軟骨干細(xì)胞能成功的向軟骨細(xì)胞進(jìn)行分化。根據(jù)國(guó)際干細(xì)胞治療協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)［10］，本研究分選出的細(xì)胞滿足了絕大部分對(duì)干細(xì)胞定義的要求。

總的來(lái)說(shuō)，本研究認(rèn)為軟骨中存在著軟骨干細(xì)胞，并成功的對(duì)軟骨干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，從而可能為軟骨組織工程提供了新的種子細(xì)胞來(lái)源，也為軟骨損傷的原位修復(fù)提供了希望，但對(duì)軟骨干細(xì)胞的生物學(xué)特性，還需要進(jìn)一步的研究。

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