不同商品規(guī)格川貝母總生物堿含量測定的方法研究

王純玉，何祖新，吳玉良

(1.四川省攀枝花市中西醫(yī)結合醫(yī)院，四川 攀枝花 617000;2.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137;3.四川康定金珠制藥有限責任公司，四川 康定 626100)

川貝母(Szechwan fritillary bulb)是來源于百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaries L.)中多種植物的鱗莖，使用歷史悠久，漢代《神農本草經(jīng)》早有記載，列為中品，具有清熱潤肺、化痰止咳的作用。2010年版《中國藥典(一部)》只收載了川貝母，包括6個基源種、4個商品規(guī)格，以同一質量標準進行質量控制[1]，沒有體現(xiàn)不同規(guī)格等級川貝母的質量差異[2－3]。筆者以西貝母堿為對照品，探索采用酸性染料比色法[4－6]測定4個不同商品規(guī)格的川貝母中總生物堿含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

BP211D型電子天平(賽多利斯公司);TU－190型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);HHS－21－4型電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏凱儀器廠)。川貝母(四川康晨生物科技有限公司提供);西貝母堿(中國藥品生物制品檢定所，批號為110767－2005045);三氯甲烷、甲醇、氨水均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取西貝母堿對照品適量，精密稱定9.98mg，置50mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，制成質量濃度為0.199 6 g/L的對照品溶液。取本品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液4mL，浸潤0.5 h，加三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液40mL，置80℃水浴加熱回流2 h，放冷，濾過，濾液置50mL容量瓶中，用適量三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷－甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，搖勻;精密量取5mL，置25mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10mL使溶解，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液(取溴甲酚綠0.05 g，用0.2moL/L氫氧化鈉溶液6mL使溶解，加磷酸二氫鉀1 g，加水溶解并稀釋至100mL)3mL，密塞，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置30min，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 檢測波長選擇

精密量取西貝母堿對照品溶液1mL，加三氯甲烷至10.0mL，精密加水5mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液3mL，密塞，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置30min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應的試劑為空白，用島津TU－1901型紫外可見近紅外分光光度計進行光譜掃描(190～900 nm)。由光譜圖(圖1)可見，對照品西貝母堿在414 nm波長處有最大吸收，故選擇414 nm作為檢測波長。

圖1 西貝母堿紫外吸收光譜圖

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密量取對照品溶液5mL，稀釋至50mL，再精密量取 1，2，3，5，10mL，分別置 25mL 具塞試管中，加三氯甲烷至10.0mL，精密加水5mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液3mL，密塞，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置30 min，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法，在414 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。得回歸方程 Y=0.016 64X－0.011 51，R2=0.996 9(n=5)。結果表明，西貝母堿質量濃度在19.96～199.6μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

精密度試驗:精密量取同一對照品溶液1.0mL于25mL具塞錐形瓶中，按照線性關系考察項下方法，測定吸光度。結果吸光度平均值為0.494 6，RSD為0.23%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:在室溫下取對照品溶液和供試品溶液，按照線性關系考察項下方法，于0，1，2，4，8 h時依法測定吸收度。結果對照品溶液和供試品溶液吸光度的 RSD分別為0.56%和1.65%，均小于2.0%(n=5)，表明兩者在室溫下8 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一川貝母5份，每份2 g，依法制備供試品溶液并測定吸光度，計算含量。結果樣品中總生物堿含量的平均值為 1 382.2 μg/g，RSD 為 0.63%(n=5)，表明方法重復性好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(1 382.2μg/g)6份，每份1 g，精密稱定，分別精密加入西貝母堿對照品適量，置50mL具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 西貝母堿加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取4種不同規(guī)格的川貝母，按2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中西貝母堿的質量(μg)，計算總堿的含量。結果見表2。

表2 不同規(guī)格川貝母總堿含量測定結果(%)

3 討論

彭士梅等[7]采用貝母素甲為指標成分，測定貝母中總堿的含量。而2010年版《中國藥典(一部)》采用的指標成分為西貝母堿[1]，故本研究中選擇西貝母堿作為川貝母含量測定的指標成分。

酸性染料比色法是目前測定貝母類總生物堿最常用、可靠的方法。本研究中曾還采用兩性滴定法測定總堿的含量[8]，試驗結果表明，酸性染料比色法結果更準確、可靠，操作簡便可行，適用于川貝母的質量控制。

試驗過程中還發(fā)現(xiàn)有問題需要改進:水浴回流提取時水浴溫度不能過高，如果溫度過高，劇烈沸騰可使大量粉末沖出溶液，附于無溶劑的燒瓶壁上，使生物堿不能被充分提取，致使含量測定結果偏低;加入溴甲酚綠染色的量還要進一步考察確定，本試驗中加入2，3，5mL，吸光度值會隨著加入量的增加而改變，3mL已能充分染色;振搖要非常仔細，以使反應完全，振搖后應置分液漏斗中靜置20～30min，使水層與氯仿層充分分層，并將氯仿層用干燥濾紙濾過，以除去氯仿層可能含有的水及染料。本試驗結果顯示，栽培品的總生物堿含量最高，與傳統(tǒng)的品質評價標準有差異。現(xiàn)行版藥典僅以總生物堿含量作為川貝母的質量控制指標不很全面，而且不同規(guī)格川貝母之間的含量差別較大，應該研究更全面、可行的方法來控制川貝母的質量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:34.

[2]張榮發(fā).川貝母的研究進展[J].中國藥業(yè)，2006，15(8):62.

[3]唐小鵬，唐生斌，魏艷陽.川貝母混偽品的基源和性狀鑒定[J].中國藥業(yè)，2002，11(10):64.

[4]王沖之，孫 健.貝母類藥材生物堿及生物堿苷含量測定方法學研究[J].中國藥學雜志，2003，38(6):415 －418.

[5]王艷紅，吳曉民，鄭友蘭.不同產地和采收期的平貝母總生物堿含量[J].中藥材，2006，29(1):8 －10.

[6]丁 霞，李幼榮，房克慧.酸性染料比色法測定浙貝母中總生物堿的含量[J].中國藥業(yè)，1999，8(10):46.

[7]彭士梅，高明遠.酸性染料比色法測定川貝母中的貝母甲素的含量[J].中國藥事，2006，20(11):687－688.

[8]蔣愛芳，楊義芳，黃文武.酸性染料比色法測定總生物堿的研究進展[J].中草藥，2006(37):359－361.