甲磺酸加貝酯在小腸缺血－再灌注損傷中的預(yù)防作用

王 健，劉振芬

(四川省隆昌縣人民醫(yī)院藥劑科，四川 內(nèi)江 642150)

缺血－再灌注(I/R)，損傷是臨床實踐中最常見的組織器官損傷的病因之一，涉及氧自由基的產(chǎn)生，損傷區(qū)炎性細(xì)胞浸潤等多因素、多階段復(fù)雜的病理生理過程。腸I/R損傷引起消化道局部組織的損害可誘發(fā)腸內(nèi)細(xì)菌移位、大量毒素進(jìn)入體循環(huán)，引起炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子釋放從而導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)、多器官功能衰竭(MODS)甚至死亡[1]。近年來，根據(jù)I/R損傷的發(fā)生機(jī)制采用缺血預(yù)處理，低溫低流量再灌注，抑制、清除氧自由基氧的產(chǎn)生，抗白細(xì)胞聚集黏附等治療方法來減輕I/R后損傷[2]。然而，迄今尚無一種特效方法能徹底解決這一醫(yī)學(xué)難題。甲磺酸加貝酯是一種非肽類蛋白酶抑制劑，可抑制胰蛋白酶、激肽釋放酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶等多種蛋白酶的活性，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕炎性反應(yīng)。本試驗運(yùn)用兔腸I/R模型，頸外靜脈應(yīng)用甲磺酸加貝酯治療，觀察其在腸I/R損傷中的保護(hù)作用，旨在探求防治腸I/R損傷的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

健康新西蘭白兔60只，體重(2.0±0.3)kg，均購于瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，雌雄不限，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組、腸I/R組和藥物治療組，每組15只。甲磺酸加貝酯注射液由四川陽光潤禾藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格為100mg/支的水溶液。

1.2 方法

標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。手術(shù)前12 h開始禁食，不禁水，腹腔注射2%硫噴妥鈉3mL/kg麻醉后，取右側(cè)臥位，固定于手術(shù)臺上。右腹股溝區(qū)、左腹部備皮、消毒，切開分離出右股動脈，插管，接三通管并連接含有肝素的0.9%氯化鈉注射液(肝素0.01 g/L)5mL注射器上(供抽血用)。手術(shù)分離腸系膜上動脈(SMA)后，用無損傷血管夾夾閉其根部，1 h后松夾再灌注，關(guān)閉切口，術(shù)后按試驗組分籠飼養(yǎng)。

1.3 動物試驗?zāi)Ｐ椭谱?/h3>

將動物隨機(jī)分成4組，每組15只。模型組:將動物進(jìn)行上述操作，動脈夾夾閉SMA 1 h松夾;藥物治療組:操作同模型組，在夾閉SMA 30min后經(jīng)頸外靜脈脈注射甲磺酸加貝酯30mg/kg;假手術(shù)組:動物進(jìn)行上述操作，但不夾閉SMA;正常組:不進(jìn)行手術(shù)，正常飼養(yǎng)，麻醉后立即取標(biāo)本。其余組再灌注6 h后采集門、體靜脈血，行左肺灌洗并收集支氣管－肺泡灌洗液(BALF)，取右肺、肝及小腸組織。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

取回盲部近端約16 cm處腸管4 cm，常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色;應(yīng)用OLYMPASBX－50多功能顯微鏡，觀察不同視野并選片照相。運(yùn)用顯微圖像分析系統(tǒng)(VIDAS)隨機(jī)選出每張切片上黏膜內(nèi)的3個視野進(jìn)行圖像分析，測其平均吸光度值(A值)。腸組織病理分級遵照Chiu等[3]的標(biāo)準(zhǔn)，按照雙盲法原則進(jìn)行。BALF中蛋白含量采用磺基水楊酸透射比濁法測定;門、體靜脈血內(nèi)毒素采用偶氮顯色法測定，試劑盒由北京醫(yī)學(xué)化驗所提供;肺組織中髓過氧化酶(MPO)含量測定參考Krawisz等[4]的方法。放血處死動物后迅速開胸整塊取出肺、肝及小腸組織，立即以0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行勻速灌洗;取8～12 g肺組織，加入80mL含0.5%十六烷基三甲基溴化胺的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.4)，用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)將其治成組織均漿，離心15min，取20mL上清液加0.3%過氧化氯溶液1.8mL、100mmol/L 4磷酸鉀緩沖液30mL及0.041mol/L二茴香胺溶液20mL;用724型分光光度計在460 nm波長處測定1～3min時 A值變化值，按照公式MPO活性=△A460×13.5/肺重量(g)計算每克濕肺組織的MPO活性。以每10個高倍視野中中性粒細(xì)胞(PMN)的數(shù)目測定肝組織病理切片中PMN浸潤程度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料的比較采 t檢驗或方差分析，等級資料的比較采用秩和檢驗，取 α =0.05。

2 結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，正常組與假手術(shù)組絨毛上皮細(xì)胞排列規(guī)整，腸壁組織均勻。模型組可見腸上皮細(xì)胞明顯水腫，壁變薄，小腸絨毛短細(xì)間距變寬;部分上皮細(xì)胞壞死脫落，腸黏膜固有層內(nèi)腺體可見灶性區(qū)域壞死及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤;模型組腸病理分級明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)和正常組(P＜0.01)，見表 1。腸I/R損傷致多器官損傷指標(biāo)比較見表2。腸I/R對組織中PMN的影響見表3。

表1 各組兔腸的病理分級(只，n=5)

3 討論

小腸黏膜是迄今發(fā)現(xiàn)I/R損傷最敏感的臟器之一，腸I/R是應(yīng)激狀態(tài)中必經(jīng)的病理生理過程。目前認(rèn)為，腸黏膜低灌注、氧自由基損傷及細(xì)胞因子作用是腸黏膜三大主要致傷因素[5]。黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)、線粒體功能受損、兒茶酚胺自身氧化增加等而導(dǎo)致部分動物或患者細(xì)胞功能代謝障礙及腸上皮細(xì)胞壞死、微絨毛分離及固有層崩解[6]。另外，腸道屏障破壞后細(xì)菌移位，細(xì)菌毒素入血后而導(dǎo)致時空性炎性反應(yīng)和毒血癥[7]，其誘發(fā)的MODS和膿毒癥的研究一直是國內(nèi)外的熱點(diǎn)、難點(diǎn)，但目前尚缺乏對缺血后腸黏膜局部炎癥損害和全身炎性反應(yīng)無針對性的治療藥物。

表2 腸I/R致多器官損傷各組指標(biāo)比較(±s)

表2 腸I/R致多器官損傷各組指標(biāo)比較(±s)

注:與正常組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01;與模型組相比較，＊P＜0.05，#P＜0.01;與假手術(shù)組相比，□P ＜0.05，■ P ＜0.05。下表同。

組別正常組假手術(shù)組模型組藥物治療組門靜脈內(nèi)毒素(pg/mL)4.42 ±0.92 6.04 ±0.88 17.79 ±4012▲□10.18 ±1.66△體靜脈內(nèi)毒素(pg/mL)3.81 ± 1.22 4.23 ± 1.08 14.02 ± 1.70△■7.13 ± 1.45△BALF蛋白(10×mg/L)81.745 ±0.158 10.645 ±1.179▲19.167 ±1.590■10.268 ±1.931▲#血清GPT(U/L)45.188 ±3.793 201.668 ±11.547▲153.912 ±12.146▲101.801 ±10.971△＊

表3 腸I/R對組織中PMN的影響(±s)

表3 腸I/R對組織中PMN的影響(±s)

組別正常組假手術(shù)組模型組藥物治療組肝PMN(個/10HPF)11.666 ± 1.567 14.201 ± 1.617 35.121 ± 3.337■19.068 ± 2.731△#腸MPO(A/g)0.003 ± 0.002 0.005 ± 0.001 0.164 ± 0.030▲□0.068 ± 0.016▲#肺MPO(A/g)0.153 ± 0.041 0.796 ± 0.160▲1.266 ± 0.181■0.580 ± 0.083▲#

本研究中觀察了靜脈給予甲磺酸加貝酯對腸I/R損傷后的全身炎性反應(yīng)及多器官功能障礙的影響，結(jié)果表明，在腸缺血早期腸內(nèi)給予甲磺酸加貝酯能多靶點(diǎn)干預(yù)腸I/R損傷的基本病理環(huán)節(jié)，增加腸黏膜血流量，降低血漿腫瘤壞死固子α(TNF－α)的水平，抑制PMN活化、聚集，減輕肝、肺、小腸及腸系膜淋巴結(jié)炎性細(xì)胞浸潤及組織損傷，從而減輕炎性反應(yīng)，對于防治腸I/R損傷和MODS具有潛在臨床應(yīng)用價值。PMN活化可與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附從而促進(jìn)氧自由基及溶酶體酶釋放造成組織損傷，是引起MODS的共同原因之一;PMN與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附還能造成微循環(huán)障礙，組織器官內(nèi)皮細(xì)胞水腫，阻礙血紅蛋白向組織細(xì)胞釋放氧，進(jìn)一步加重組織損傷。在本研究中發(fā)現(xiàn)，腸I/R中肝、肺等遠(yuǎn)端組織器官均可見PMN等炎癥細(xì)胞浸潤增加，提示PMN在腸I/R以及所致的全身炎性反應(yīng)及MODS中有重要作用，抑制PMN的活性有望成為治療和預(yù)防I/R的新的潛在靶點(diǎn)。

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