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    心肌梗死模型大鼠心肌組織基因表達(dá)變化及縫隙連接相關(guān)基因分析1)

    2013-09-14 09:25:38吳愛明翟建英張冬梅婁利霞朱海燕趙明鏡王碩仁
    關(guān)鍵詞:縫隙連接基因芯片差異基因

    吳愛明,翟建英,張冬梅,婁利霞,朱海燕,趙明鏡,王碩仁

    心肌梗死(MI)是威脅人類健康的主要疾病之一[1],在我國發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢[2]。雖然隨著MI后再灌注治療的普及,患者早期死亡率大幅降低[3],但是幸存的MI患者仍具有發(fā)生致死性心律失常的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。這與基因的改變和調(diào)控密不可分。因此,有必要從基因水平研究MI后心律失常的發(fā)生機(jī)制,以進(jìn)一步降低MI患者的猝死率。本研究制作MI大鼠模型,進(jìn)行了左心室心肌組織的全基因組表達(dá)譜芯片檢測和分析,并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)方法驗(yàn)證了心肌細(xì)胞間縫隙連接通路相關(guān)的3條基因,旨在為進(jìn)一步從基因水平認(rèn)識MI后心律失常發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠,平均體重220g~250g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,許可證編號:SCXK(京)2002-0003。

    1.2 主要儀器 RSP1002型呼吸機(jī)(美國Kent公司),心電示波儀(上海醫(yī)學(xué)電子儀器廠),雜交爐(美國Agilent公司),掃描儀(美國 Agilent公司),分光光度計(jì)(美國Nanodrop公司),Realtime PCR儀(美國Stratagene公司)。

    1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒(美國Promega公司),RT試劑盒(美國Promega公司),SYBER Green染料(美國ABI公司)。Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片(生物芯片上海國家工程研究中心)。

    1.4 動(dòng)物模型制備與分組方法 大鼠隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組,參照文獻(xiàn)[5]制作 MI大鼠模型,用戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉,固定備皮,氣管插管,連呼吸機(jī)和心電圖儀。在左胸第三、四肋間開胸約1.5cm,用眼科彎鑷輕提左心耳,在動(dòng)脈圓錐與左心耳之間下約1mm處用5/0手術(shù)線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,迅速關(guān)胸縫合。心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段顯著抬高表示結(jié)扎成功。假手術(shù)組只穿線,不結(jié)扎。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)1個(gè)月取材。

    1.5 心肌組織的基因芯片檢測和生物學(xué)信息分析方法 由生物芯片上海國家工程研究中心完成。首先提取心肌組織樣本的總RNA,質(zhì)檢合格后進(jìn)行總RNA純化,cDNA合成,cRNA合成,cRNA純化,cRNA單熒光染料(Cy3)標(biāo)記,芯片雜交、洗滌、掃描,歸一化處理等一系列步驟,得到基因芯片檢測結(jié)果。然后對模型組和假手術(shù)組的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析,根據(jù)基因在兩個(gè)分組中幾何平均數(shù)的比值倍數(shù)決定差異基因的變化方向,比值大于1的基因?yàn)樯险{(diào)基因,小于1的是下調(diào)基因。用Fold Change值表示兩組數(shù)據(jù)均一化以后的信號值的差異倍數(shù)。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change值≥2或≤0.5。在此基礎(chǔ)上利用京都基因與基因組百科全書(The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)細(xì)胞通路(pathway)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因的pathway注釋,對差異基因富集的pathway進(jìn)行歸類,初步分析MI后pathway的變化。

    1.6 心肌組織縫隙連接蛋白43(Cx43)、蛋白激酶C(PKC)、酪蛋白激酶1(CK1)的mRNA檢測方法 登陸GenBank檢索基因序列,用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Cx43上游引物:5′-TTCATGCTGGTGGTGTCC-3′;下游引物:5′-AGTGGTGGCGTGGTAAGG-3′。CK1 上游引物:5′-TACCGCCAACCGACTCCGAAGT-3′ ;下游引物:5′-GCGCACCTCTGTGGAGTCTCAT-3′。PKC 上游引物:5′-GCTTCAACATCGACATGCCTCACC-3′;下游引物:5′-ACATTCATGCCGCAGTCTTCACACT-3′。內(nèi) 參 基 因 β-Actin 上游引物:5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′;下游引物:5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′。提取左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織總RNA,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA,加入SYBR Green PCR Master Mix組成251反應(yīng)體系,每個(gè)樣本做3個(gè)平行管,進(jìn)行Real-time PCR檢測。擴(kuò)增條件均為:95℃10min變性后;95℃30s,55℃30s,72℃20s,共40個(gè)循環(huán)。以β-Actin作為內(nèi)參,將所得Ct值按照2(-ΔΔct)的方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量,以差異倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 RNA純度和完整性檢測結(jié)果(見表1) 總RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測,OD260nm/OD280nm,比值介于1.8~2.1;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,28S、18S兩條帶清晰可見,且無拖尾現(xiàn)象,提示完整性良好,可以進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測。

    表1 RNA抽提檢測結(jié)果

    2.2 基因芯片檢測和生物學(xué)信息分析結(jié)果 Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片采用Cy3單色熒光標(biāo)記,芯片涵蓋了41 012個(gè)大鼠基因。按照差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn),與假手術(shù)組比較,模型組共篩選出上調(diào)表達(dá)的基因3 136條,下調(diào)表達(dá)的基因2 222條。pathway富集度分析顯示,這些差異基因共涉及了130個(gè)pathway。對檢索到的pathway進(jìn)行初步歸類,主要涉及了糖、脂、核酸、氨基酸、能量等新陳代謝pathway;基因轉(zhuǎn)錄、蛋白水解、修飾等遺傳信息處理pathway;膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子等環(huán)境信息處理pathway;還有運(yùn)輸分解、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長、死亡以及細(xì)胞間通訊等細(xì)胞過程pathway。其中與MI后心律失常發(fā)生關(guān)系比較密切的是細(xì)胞通信pathway,并且其重要分支縫隙連接pathway中的關(guān)鍵蛋白Cx43及其上游激酶CK1和PKC的基因表達(dá)出現(xiàn)了顯著的下調(diào)和上調(diào)。

    2.3 MI大鼠心肌組織Cx43、PKC、CK1mRNA檢測結(jié)果 采用Real-time PCR檢測相關(guān)基因表達(dá),與假手術(shù)組比較,模型組Cx43和CK1mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01),PKC mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)。詳見表2。

    表2 MI大鼠心肌組織Cx43、CK1、PKC mRNA表達(dá)的比較(±s)

    表2 MI大鼠心肌組織Cx43、CK1、PKC mRNA表達(dá)的比較(±s)

    組別 n Cx43mRNA CK1mRNA PKC mRNA假手術(shù)組7 1.02±0.21 1.00±0.07 1.03±0.23模型組 6 0.54±0.35 0.78±0.16 1.35±0.23 P<0.05 <0.01 <0.05

    2.4 MI大鼠心肌組織Cx43與CK1、PKC mRNA表達(dá)的相關(guān)分析結(jié)果 經(jīng)Pearson相關(guān)分析,MI大鼠心肌組織Cx43mRNA表達(dá)與CK1mRNA呈顯著正相關(guān)(P<0.01),與PKC mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見表3。

    表3 MI大鼠心肌組織Cx43與CK1、PKC mRNA表達(dá)的相關(guān)分析

    3 討 論

    基因芯片技術(shù)是指通過微陣(Microarray)技術(shù)將高密度的DNA片段附著在固相表面,以同位素或熒光標(biāo)記的DNA探針,借助堿基互補(bǔ)雜交原理,進(jìn)行大量基因表達(dá)測試,具有高通量的特點(diǎn)[6]。基因芯片實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括基因表達(dá)測試——生物信息學(xué)分析——驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)三部分,本研究嚴(yán)格遵循了這些技術(shù)要求?;虮磉_(dá)測試采用了比較成熟的Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片,然后借助KEGG pathway數(shù)據(jù)庫對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)的分析,最后用Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行了感興趣基因的驗(yàn)證。

    本研究結(jié)果提示,MI后心臟基因表達(dá)發(fā)生了復(fù)雜的變化,出現(xiàn)了上千條基因的上調(diào)和下調(diào),初步歸類這些差異基因發(fā)現(xiàn)涉及的pathway主要包括:糖、脂、氨基酸、能量等眾多代謝過程,并且基因轉(zhuǎn)錄、蛋白水解、修飾、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等遺傳信息和環(huán)境信息的處理也都表現(xiàn)出一定差異。此外,在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、生長、死亡和細(xì)胞間通訊等細(xì)胞過程的pathway同樣出現(xiàn)了基因異常表達(dá)。其中與MI后心律失常發(fā)生關(guān)系比較密切的是細(xì)胞通信pathway。細(xì)胞通信是細(xì)胞間精確和高效的發(fā)送與接收信息的通訊機(jī)制。細(xì)胞通信pathway包括多種方式,就心室肌組織而言,縫隙連接pathway是其重要分支,由Cx43構(gòu)成的心肌縫隙連接對心電活動(dòng)影響巨大,它是維持心臟電活動(dòng)協(xié)調(diào)性和同步性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一[7]。Cx43的異常將導(dǎo)致心室肌細(xì)胞電活動(dòng)的整體性異常,從而使傳導(dǎo)的速度和傳導(dǎo)的各向異性發(fā)生改變,引起折返和傳導(dǎo)阻滯[8,9],最終誘發(fā)惡性心律失常而危及患者生命。在縫隙連接pathway中Cx43受多種因素調(diào)節(jié),本研究的基因芯片和熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果均表明,MI后Cx43的上游調(diào)節(jié)因子中CK1和PKC mRNA的異常表達(dá)明顯,可能共同導(dǎo)致了Cx43mRNA表達(dá)的下調(diào)。相關(guān)分析證實(shí)了這一推測,CK 1對Cx 4 3的基因表達(dá)有正調(diào)節(jié)作用(r=0.765,P<0.01),PKC對Cx43的基因表達(dá)有負(fù)面影響(r=-0.645,P<0.05)。CK1與Cx43的正相關(guān)關(guān)系可能與CK1促進(jìn)縫隙連接通道的裝配有關(guān)[10]。而PKC則是通過調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化而下調(diào)了Cx43介導(dǎo)的心肌細(xì)胞間通訊[11]。上述研究結(jié)果,對于從基因水平闡明MI的病理變化具有積極意義,特別是心肌細(xì)胞間縫隙連接通路的Cx43及其上游CK1和PKC mRNA的變化規(guī)律,將為深化對MI后心律失常的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和從基因水平防治心律失常發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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