α-硫辛酸對卡那霉素致離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的防護(hù)作用

王愛梅 許 濤 劉雙月 牟 華 (遼寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

卡那霉素(KM)作為一種氨基糖苷類抗生素(AmAn)，具有嚴(yán)重的耳毒性副作用，可導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷。目前認(rèn)為，KM的耳毒性機(jī)制與其促進(jìn)氧自由基的過量生成并進(jìn)而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。據(jù)此，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用抗氧化劑來防護(hù)KM 的耳毒性〔1，2〕。α-硫辛酸(LA)是一種新型抗氧化劑，具有清除氧自由基、螯合鐵離子等多種作用〔3〕，可有效防護(hù)慶大霉素對大鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷〔4〕。本文研究LA對KM所致離體培養(yǎng)小鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 生后3 d的昆明小鼠120只(240耳)，雌雄兼用，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。硫酸KM粉劑購自美國Ameresco公司，LA、牛血清白蛋白(BSA)和TRITC-鬼筆環(huán)肽均購自美國Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，Ⅰ型鼠尾膠購自中國杭州生友公司，基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基(BME)干粉、碳酸氫鈉和Hanks液購自北京邁晨生物科技有限公司，SOD試劑盒、MDA試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耳蝸基底膜取材 用75%乙醇噴灑小鼠全身進(jìn)行皮膚表面消毒，斷頭后沿矢狀縫剪開顱骨，去除腦組織以充分暴露顱底。體視顯微鏡下取出整個(gè)耳蝸并移入預(yù)冷的Hanks液中。打開耳蝸殼，依次剝離螺旋韌帶、前庭膜及血管紋等結(jié)構(gòu)，用游絲鑷夾住基底膜底回末端，將基底膜沿蝸軸完整分離。

1.2.2 耳蝸螺旋器培養(yǎng) 預(yù)先在培養(yǎng)皿中滴入10 μl新鮮配制的膠原凝膠液(由Ⅰ型鼠尾膠、10×BME和2% 碳酸氫鈉按9∶1∶1比例配制而成)，室溫下放置15～20 min，待膠原凝膠液凝固后加入含1%BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基1 ml。將分離后的每個(gè)基底膜平鋪到凝膠表面。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，再加入1 ml培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基完全覆蓋凝膠，然后將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及離體KM耳毒模型的制備 經(jīng)培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基。將基底膜隨機(jī)分為6組，每組40條。其中A組為對照組，加入2 ml新鮮培養(yǎng)基;B組為KM組，加入2 ml含有0.3 mmol/L KM的新鮮培養(yǎng)基;C、D、E組為KM+LA組，分別加入2 ml含有0.3 mmol/L KM和不同濃度LA(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L)的新鮮培養(yǎng)基;F組為LA組，加入2 ml含有1.0 mmol/L LA的新鮮培養(yǎng)基。各組均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后終止實(shí)驗(yàn)。每組隨機(jī)選取10條基底膜用于TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色，另外30條用于SOD活力和MDA含量測定。

1.2.4 TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色 終止實(shí)驗(yàn)時(shí)吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS溶液，4℃下固定過夜。PBS漂洗3次后取下帶有基底膜的凝膠，浸入0.25%Triton X-100溶液中，室溫下處理20 min。然后移入到TRITC-鬼筆環(huán)肽(1∶200稀釋)溶液中，室溫下避光染色30 min。PBS漂洗后將帶有基底膜的凝膠移至滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5 耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 將標(biāo)本置于熒光顯微鏡下，選取0.17 mm標(biāo)尺為一個(gè)視野，從基底膜頂端向底端連續(xù)觀察毛細(xì)胞，并將毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用耳蝸毛細(xì)胞定量分析軟件(KHRI Cytocochleograms，Version 3.0)，分別選取距離耳蝸蝸頂12% ～20%、44% ～52%、84% ～92%的三個(gè)區(qū)域，自動計(jì)算出毛細(xì)胞的缺失百分率。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量測定 終止實(shí)驗(yàn)時(shí)吸出培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每6條基底膜合成一份標(biāo)本放入離心管中，每組5份標(biāo)本。將標(biāo)本于常溫下超聲粉碎30 s，1 000 r/min下離心8 min。分別取上清液0.05 ml，應(yīng)用比色法和硫代巴比妥酸法分別測定耳蝸組織中SOD活力和MDA含量，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行組織蛋白定量。SOD活力單位用nU/mgpro表示，MDA含量用nmol/mgpro表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TRITC-鬼筆環(huán)肽熒光染色 熒光顯微鏡下，可見TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色呈現(xiàn)紅色熒光，主要定位在毛細(xì)胞的纖毛束。A組耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，外毛細(xì)胞(OHC)的纖毛呈典型的“V”字形排列，內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)的纖毛排列成“一”字形;B組耳蝸毛細(xì)胞出現(xiàn)纖毛倒伏、排列紊亂等形態(tài)改變，同時(shí)伴有毛細(xì)胞的大量缺失，尤其底回IHC、OHC均全部崩解，呈瘢痕狀結(jié)構(gòu);C、D和E組耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)改變較KM組有所減輕，毛細(xì)胞的缺失亦比KM組顯著減少，并且隨著LA濃度的增大，其效應(yīng)亦明顯增強(qiáng);F組耳蝸毛細(xì)胞纖毛排列整齊，無倒伏及融合，且毛細(xì)胞無缺失。見圖1。

2.2 耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 與A組比較，B組耳蝸IHC、OHC缺失率均明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。C、D和E組耳蝸IHC、OHC缺失率較B組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且隨著LA濃度的逐漸增大，耳蝸底回IHC、OHC缺失率亦逐漸減小，呈明顯的量效關(guān)系，且各劑量間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);F組與A組比較無顯著差異。見表1和表2。

表1 各組耳蝸IHC缺失率(%，±s，n=10)

表1 各組耳蝸IHC缺失率(%，±s，n=10)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.01;與C組比較:3)P＜0.05;與D組比較:4)P＜0.01，下表同

組別12% ～20% 44% ～52% 84% ～92%A 0.31±0.41 0.32±0.48 0.67±0.48 B 16.10±9.561) 57.62±4.161) 94.50±1.811)C 0.53±1.062) 8.31±4.201) 30.91±7.872)D 1.42±1.652) 6.61±4.241) 10.09±3.782)3)E 0.93±0.932) 4.06±2.612)3) 5.16±3.592)3)4)F 1.24±0.92 1.39±0.68 1.11±0.73

表2 各組耳蝸OHC缺失率(%，±s，n=10)

表2 各組耳蝸OHC缺失率(%，±s，n=10)

組別12% ～20% 44% ～52% 84% ～92%A 0.36±0.52 0.32±0.48 0.67±0.48 B 23.30±6.761) 65.13±8.541) 94.90±0.891)C 1.08±1.532) 9.18±1.272) 42.85±4.302)D 1.43±1.412) 8.39±0.862) 27.94±6.032)3)E 1.08±0.772) 3.73±1.422)3) 6.97±2.192)3)4)F 1.04±0.80 1.08±0.97 0.84±0.46

2.3 LA對小鼠耳蝸組織中SOD活力和MDA含量的影響 B組耳蝸組織中SOD活力明顯下降，MDA含量則明顯增多，與A組比較有顯著性差異(P＜0.05)。C、D和E組耳蝸組織中SOD活力較B組明顯增強(qiáng)，而MDA含量則較B組明顯減少(P＜0.05)，并且呈明顯的量效關(guān)系。F組耳蝸組織中SOD活力明顯高于A組(P＜0.05)，MDA含量則較A組無明顯差異。見表3。

表3 不同濃度LA對小鼠耳蝸SOD活力和MDA含量的影響(±s，n=5)

表3 不同濃度LA對小鼠耳蝸SOD活力和MDA含量的影響(±s，n=5)

組別 SOD(nU/mgpro) MDA(nmol/mgpro)A 46.21±1.25 3.23±0.15 B 22.54±1.141) 9.43±0.311)C 28.86±1.602) 6.07±0.062)D 35.04±0.632) 5.37±0.152)E 39.42±1.912)4) 4.60±0.102)4)F 56.02±1.511)3.08±0.08

3 討論

研究表明，AmAn可與鐵離子形成復(fù)合物，該復(fù)合物具有氧化還原活性，能活化氧分子，生成過量的超氧陰離子自由基(O－2)〔1〕。O－2不僅可直接破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，而且還能派生出羥自由基、過氧化氫等其他毒性分子，從而加重對機(jī)體的損害。此外，O2－及其派生物還可引發(fā)細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化并因此生成過多的脂質(zhì)過氧化物。SOD能清除O－2，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力高低可間接反映機(jī)體清除自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化物在機(jī)體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物，其含量多少可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷程度。本研究表明KM對離體培養(yǎng)的小鼠耳蝸毛細(xì)胞造成損傷。氧自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)參與了KM對離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷。

LA是一種二巰基化合物，可直接與鐵離子螯合成親脂性復(fù)合物，從而抑制鐵離子催化的花生四烯酸氧化，以減少O－2的產(chǎn)生，阻止細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化〔5〕，是目前已知天然抗氧化劑中效果最強(qiáng)的一種。在體實(shí)驗(yàn)表明，LA能有效減輕慶大霉素對大鼠耳蝸毛細(xì)胞的損害〔4〕。此外，LA亦對噪聲暴露下大鼠的耳蝸損傷和毛細(xì)胞缺失具有防護(hù)作用〔6〕。最近研究顯示，LA可通過抑制耳蝸內(nèi)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3(NOX3)的表達(dá)，以減少活性氧的生成，從而有效防護(hù)順鉑所致大鼠聽力喪失〔7〕。本研究說明LA在離體情況下能有效防護(hù)KM對小鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷，能有效提高SOD活力，以清除過量的O－2，進(jìn)而減少脂質(zhì)過氧化物及代謝終產(chǎn)物MDA的生成，保護(hù)小鼠耳蝸毛細(xì)胞免受KM的毒性破壞。

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