促排卵聯(lián)合PureceptionTM 密度梯度法優(yōu)選精子在AIH中的應(yīng)用

柒銘銘，凌國燦，周建萍

(湖南省株洲市一醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心,湖南 株洲 412000)

夫精人工受精(AIH)是將丈夫的精液經(jīng)洗滌、上游或離心等方法處理后去除精漿中抑制受精的物質(zhì)、前列腺素、免疫性細(xì)胞和抗精子抗體等,優(yōu)選提取高活力的精子注入女方子宮腔內(nèi)以獲得妊娠的助孕技術(shù),同時女方可促排卵治療以增加排卵數(shù)量,從而提高妊娠率。

精子的優(yōu)選是該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,精子優(yōu)選的方法主要有上游法和密度梯度離心法,所用的精子處理液也各不相同,現(xiàn)對我院行AIH 治療的不孕癥患者的病例資料進(jìn)行回顧性分析,探討PureceptionTM 密度梯度離心法聯(lián)合促排卵治療的AIH臨床妊娠率。

1 材料與方法

1.1 研究對象

一般資料2008年12月～2012年12月在我院行AIH 治療的不孕患者59例共113 周期,其中原發(fā)性不孕24例,繼發(fā)性不孕35例,患者年齡25.7～42.3 歲,平均年齡32.7 歲,不孕年限2～17年,平均5.6年,不孕原因包括：排卵異常（6例），輕度少弱精癥（30例），精液不液化或液化不全(12例)，免疫性不孕(5例），性功能障礙(3例），宮頸因素(3例），在行IUI 治療前，按WHO 標(biāo)準(zhǔn)對男方精液分析2～3次，女方無全身性疾病及傳染病，行子宮輸卵管碘油造影或腹腔鏡下通液檢查,至少一側(cè)輸卵管通暢。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集

禁欲3～7天后留取精液于無菌取精杯中,標(biāo)記患者夫婦姓名，待精液完全液化后按WHO（第四版）《人類精液及精子--宮頸精液實驗室檢驗手冊》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液分析，用Macro 精子計數(shù)板手工法計數(shù)精子數(shù)量。

1.2.2 精子處理方法

①取40%和80% Pureception 液各1mL,預(yù)熱至37℃。②在2095 離心管內(nèi)，依次放入80%和40% Pureception 液各1mL,注意不要擾亂兩層的界面。③在40%Pureception 液上方放入1～2mL 液化精液,如精液粘稠度較高，先將精液和HTF-HEPES以1：1 混合。④離心300g 20～30 分鐘。⑤小心移去精液和Pureception 液，如精子小丸不明顯或較小,留下80% Pureception 液0.5～1.0mL,加入2～3mL 含5mg/mL的HIF-HEPES，混勻。⑥離心150g 10 分鐘。⑦懸浮精子小丸在2mL的含HSA 5mg/ml的HTF-HEPES中，離心150g 10 分鐘。⑧如精子小丸很緊，小心移去所有上清液,如果精子小丸不明顯或較小，移去大部分上清液,加入0.5～1.0ml 含5mg/mL的HIF-HEPES 混勻，待用。

1.2.3 超促排卵方法

1.2.3.1 促卵泡發(fā)育方案

①克羅米芬(CC)：為我院誘導(dǎo)排卵中最常用的藥物,劑量50～100mL/d,最大劑量≤150mg/d，于月經(jīng)周期第5天開始連服5天。②尿促性腺素(HMG)：采用麗珠制藥廠生產(chǎn)的人絕經(jīng)期促性腺激素,每支含促卵泡生成素(FSH) 及促黃體生成素(LH)各75IU，以刺激卵泡發(fā)育,于絕經(jīng)第三天開始用藥,根據(jù)患者的敏感性，每天應(yīng)用75～225IU，監(jiān)測卵泡大小與血雌二醇水平以調(diào)整促性腺激素的劑量，連用5～7天。③CC+HMG：當(dāng)CC 治療二個或者三個周期,用B 超監(jiān)測卵泡生長發(fā)育緩慢或停止生長者，我們常采用CC+HMG，促進(jìn)卵泡生長。④來曲唑(LE)：劑量2.5mg～7.5mg，月經(jīng)第3～7天。

1.2.3.2 卵泡監(jiān)測及宮腔內(nèi)人工受精

月經(jīng)第8天開始經(jīng)陰道監(jiān)測卵泡大小，內(nèi)膜情況，最大卵泡直徑達(dá)18mm 時給予注射人絨毛膜促性腺素(HCG)5000～10000IU，24～26 小時后進(jìn)行宮腔內(nèi)人工授精(IUI)，用一次性IUI 管輕柔置入宮腔內(nèi)口上方約1cm 處,將處理后的精液約0.5mL 緩慢注入宮腔內(nèi)，部分于宮頸管內(nèi)，取出導(dǎo)管后抬高臀部臥床休息30 分鐘。

1.2.3.3 黃體支持

從AIH 日開始每3d 肌注HCG2000U/次×5次，黃體功能不足者，IUI 后可肌注黃體酮20～40mg/d，從AIH 日開始，共16天至驗血β-HCG。

1.2.3.4 妊娠的診斷AIH 后16d 檢測血β-HCG,AIH 后35d 行B 超檢查，有妊娠囊或者原始心管搏動，或流產(chǎn)，異位妊娠經(jīng)病理學(xué)檢查證實妊娠者，確定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料用mean±SD表示,組間率的比較采用χ2 檢驗，組間均數(shù)的比較用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PureceptionTM 密度梯度離心法對處理精液的影響

采用PureceptionTM 密度梯度離心法對患者精液的洗滌處理，結(jié)果表明，精液洗滌后比較洗滌前在精子密度、活動率、a+b 級活動數(shù)有顯著性提高，畸形率下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 精液洗滌前后結(jié)果的平均數(shù)對比

2.2 促排卵方案對妊娠率的影響

去除后三組方案，應(yīng)用例數(shù)較少，去除后，比較其他2組，處理采用χ2 檢驗，兩兩比較，采用促排卵方案的排卵周期妊娠率高于自然周期妊娠率,差異有顯著性,但四種促排卵方案妊娠率無明顯差異（表2）。

表2 促排卵方案與妊娠率

2.3 自然周期與促排卵周期妊娠結(jié)局分析

本研究表明，促排卵周期成熟卵泡數(shù)多于自然周期，促排卵周期妊娠率明顯高于自然周期，有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表3 一般情況及妊娠結(jié)局分析

3 討論

本文采用PureceptionTM 密度梯度離心法進(jìn)行優(yōu)選精子，選用的介質(zhì)PureceptionTM 是以PurespermTM的基礎(chǔ)加上HEPES 緩沖的HIF 或者Ham'sF-10[1]。將獲得精子懸液用于宮腔內(nèi)人工授精，結(jié)果顯示，132 份精液處理后精子密度、活率較處理前明顯提高,而畸形精子產(chǎn)生機率明顯降低，白細(xì)胞及細(xì)胞碎片等非精子成分明顯減少，達(dá)到了優(yōu)選的效果，將獲得的精子懸液用于AIH，周期臨床妊娠率為15.07%，表明采用PureceptionTM 密度梯度離心法優(yōu)選精子應(yīng)用于AIH 可獲得滿意的臨床妊娠率，是一種較好的AIH 前精子處理方法，這一結(jié)論符合不同精子優(yōu)選方法對優(yōu)質(zhì)精子回收率的研究。

密度梯度離心法的缺點是回收的精子活動率較上游法低,且對于精子密度＜5×109/L。逆行射精的精液質(zhì)量,密度梯度離心法并不完全適合[2]。但因進(jìn)行AIH 治療的患者精液質(zhì)量絕大部分為輕-中度精液異常，所以PureceptionTM 密度梯度離心法是一種較合適臨床廣泛使用的優(yōu)化精子方法。

人工授精可在自然周期或藥物促排卵周期進(jìn)行,對于排卵正常而男方因素導(dǎo)致不育,可行自然周期人工授精。對于不明顯原因性不孕、免疫性不孕、輕度子宮內(nèi)膜異位癥等造成的不孕最好在促排周期行AIH。本研究表明，促排卵周期與自然周期相比較，臨床妊娠率差異有顯著性,采用促排卵藥物的患者，有更高的妊娠率，應(yīng)用不同促排卵藥物的妊娠結(jié)果，以HMG和LE 最高，采用HMG 妊娠率高于CC。枸櫞酸克羅米芬為最常用的促排卵藥物，兼有雌激素和抗雌激素的作用,其作用有賴于下丘腦-垂體-卵巢軸正負(fù)反饋機制的完整性,但有研究顯示克羅米芬會降低子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性或?qū)е伦匀涣鳟a(chǎn)率上升[3]。尿促性腺素在卵泡發(fā)生過程中啟動卵泡的募集和生長,選擇優(yōu)勢化成熟,增加雌激素的水平和促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增值[4]。來曲唑是一種芳香化酶抑制劑,可抑制雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素,解除雌激素對垂體的負(fù)反饋抑制,刺激FSH 分泌,誘導(dǎo)卵泡生長發(fā)育排卵,于1999年首次用于促排卵治療，目前，有研究認(rèn)為來曲唑可作為一線臨床促排卵藥物[5]。

本研究80 個促排卵周期中,44 個CC 周期,8個CC+HMG 周期,14 個HMG 周期,14 個LE 周期,臨床妊娠率有明顯差異。Dankert 等在一個不明原因不孕和和男性因素AIH的隨機研究中發(fā)現(xiàn)HMG.CC 兩組患者促排卵后的卵泡數(shù)。臨床妊娠率均比自然周期增加,但兩組無明顯差異[6],由于CC相對于HMG 經(jīng)濟方便,對卵巢的刺激作用較弱,發(fā)生OHSS的風(fēng)險小,可作為一線用藥。促排卵增加AIH 妊娠率的機制尚不清楚,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為卵泡的數(shù)目與妊娠結(jié)局有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)卵泡數(shù)與AIH臨床妊娠率有關(guān),多卵泡發(fā)育周期妊娠率高于單卵泡發(fā)育,但妊娠率無統(tǒng)計學(xué)差異，提示促排卵增加妊娠率的機制改善了子宮內(nèi)膜的形態(tài)和功能,克服潛在的卵泡發(fā)育或排卵異常有關(guān)。總之,促排卵并不適合所有的AIH 周期,但對于子宮頸因素,不明原因不孕行人工授精夫婦聯(lián)合促排卵可能提高周期妊娠率[7]。

綜上所述,我們認(rèn)為促排卵聯(lián)合PureceptionTM密度梯度離心法治療不孕癥操作簡單,患者痛苦小,設(shè)備相對簡單,便于推廣。

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