超聲波法提取胎菊中綠原酸的研究

刁全平，侯冬巖，回瑞華，趙元元

鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，鞍山 114005

胎菊系菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥頭狀花序［1］，在花朵尚未完全張開時(shí)收摘所得，亦名小湯黃、小白菊，是浙江傳統(tǒng)道地藥材“浙八味”之一，亦可加工制成高端飲品。胎菊性微寒，味辛甘苦，對(duì)中樞神經(jīng)有鎮(zhèn)靜作用，還具有解熱和抑菌等作用［2］。綠原酸作為菊科植物中的主要藥理成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種作用［3］。目前對(duì)胎菊中綠原酸的提取檢測(cè)方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本文嘗試采用超聲波法對(duì)胎菊中綠原酸的提取進(jìn)行研究，對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、提取料液比等因素進(jìn)行考查，確定胎菊中綠原酸的最佳提取條件，并建立HPLC法測(cè)定胎菊中綠原酸的方法，為胎菊的質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，配有510泵，486可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器);N3000色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

試劑:HPLC所用的乙腈為色譜純(天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司)，其他均為分析純，水為二次蒸餾水。

胎菊購(gòu)自杭州藝福茶業(yè)有限公司。

綠原酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，大連化學(xué)物理研究所);流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(10∶90);流速為1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 供試液的制備

精確稱取樣品(約1.0 g)置于100 mL錐形瓶中，加入提取溶劑，塞緊塞子，置于超聲波清洗器中，提取一定時(shí)間后，過濾，再用提取溶劑清洗2次，合并濾液并定容于100 mL容量瓶中，0.45 μm濾膜過濾后，HPLC測(cè)定其含量，并計(jì)算提取量。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取3.0 mg綠原酸對(duì)照品置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容。然后分別準(zhǔn)確移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容。按照1.2.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(A)縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為A=32163C-41092，線性相關(guān)系數(shù) r=0.9998，表明綠原酸在15 ～90 μg/mL范圍內(nèi)線形關(guān)系良好。

1.2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

以甲醇為提取溶劑，料液比為1∶20，超聲時(shí)間為80 min對(duì)樣品進(jìn)行提取，將提取液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算提取量并計(jì)算 RSD =0.615%，說明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

1.2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取綠原酸對(duì)照品溶液，每隔2 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，計(jì)算RSD=0.344%，表明在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為0.5506 g的胎菊樣品3份，分別加入標(biāo)準(zhǔn)樣品 0.70、1.0、1.3 mg，以甲醇為溶劑，料液比為 1∶20，超聲 80 min，按照步驟 1.2.2 進(jìn)行處理，測(cè)得結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)Table 2 Recovery of chlorogenic acid

由表2可知，回收率在98.10% ～103.3%之間，平均回收率為100.3%，表明本方法準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

分別以甲醇、乙醇、丙酮、水為提取劑，按照1∶15的料液比，對(duì)樣品超聲80 min后，HPLC測(cè)定溶液中綠原酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 提取溶劑對(duì)胎菊中綠原酸提取量的影響Table 3 Effect of extraction solvent on extraction amount of chlorogenic acid

由表3可見，采用甲醇作為提取溶劑，胎菊中綠原酸的提取量較高。

2.2 提取時(shí)間的選擇

以甲醇為提取溶劑，按照1∶15的料液比，分別超聲提取 20、40、60、80、100、120 min，結(jié)果見圖 1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)胎菊中綠原酸提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction amount of chlorogenic acid

由圖1可知，提取時(shí)間為80 min時(shí)，胎菊中綠原酸的提取量最高。時(shí)間太短，提取不完全;時(shí)間太長(zhǎng)，綠原酸不穩(wěn)定，容易分解，導(dǎo)致提取量下降。所以本試驗(yàn)提取時(shí)間采用80 min。

2.3 提取料液比的選擇

以甲醇為提取溶劑，提取時(shí)間為80 min，采用不同提取料液比，考查其對(duì)提取量的影響，結(jié)果如表4所示。

表4 提取料液比對(duì)胎菊中綠原酸提取量的影響Table 4 Effect of sample-solvent ratio on extraction amount of chlorogenic acid

由表4可見，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，提取量較高，料液比為1∶25時(shí)變化不大，所以采用料液比為1∶20。

2.4 樣品的測(cè)定

精確稱取樣品1.0000 g胎菊樣品，按照最佳提取條件對(duì)其中的綠原酸進(jìn)行提取，HPLC測(cè)定其含量為 1.878 mg/g。

圖2 綠原酸對(duì)照品及胎菊HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of chlorogenic acid standard(A)and chrysanthemum bud sample(B)

3 結(jié)論

文獻(xiàn)報(bào)道綠原酸可以采用索氏提取法［4］、熱回流提取法［5，6］、超聲波提取法［7］等進(jìn)行提取，可綠原酸不穩(wěn)定，遇光及熱易分解，特別是長(zhǎng)時(shí)間受光及加熱。本文采用超聲波提取法對(duì)胎菊中的綠原酸進(jìn)行提取，盡量避免其在提取過程中的損失，確定最佳提取條件并建立了HPLC測(cè)定方法，為胎菊的質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。

1 Chinese Pharmacopoeia Committee(國(guó)家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國(guó)藥典).Beijing:China Medical Science Press，2005.Vol I，218.

2 Zhou Q(周群)，Yu XP(俞旭平)，Ren JJ(任江劍)，et al.Influence of different harvest methods and processing methods on quality of chrysanthemum morifolium.Mode Chin Med(中國(guó)現(xiàn)代中藥)，2009，11(12):24-27.

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