白三葉草植物內(nèi)生真菌煙曲霉及其次生代謝產(chǎn)物的研究

楊勇勛，董小萍 ，晏永明，陶 明，羅 茜

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137;2西昌學(xué)院輕化工程學(xué)院，西昌 615000;3中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650204

白三葉草(Trifolium repens L.)為豆科多年生草本植物，富含異黃酮類化合物，主要作為優(yōu)質(zhì)牧草與庭園綠化。近年來，對三葉草的化感作用的研究報道不斷增多，如Ross等［1］報道了7種三葉草對雜草的生長有抑制作用，而且它們對雜草的抑制作用大小不同;張曉芳等［2］報道了白三葉草的花、葉揮發(fā)物具化感作用。

當前的研究認為，植物內(nèi)生菌與寄主植物形成的是一種互生關(guān)系，而且植物內(nèi)生菌能增強植物的防御能力［3］。紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum)為一種外來入侵生物物種，現(xiàn)還未有一條有效的生物防治方法，但在紫莖澤蘭的生態(tài)學(xué)調(diào)查中，我們發(fā)現(xiàn)白三葉草群落中卻無紫莖澤蘭，說明白三葉草可能具有抑制紫莖澤蘭的能力。因此，為尋找一條防治紫莖澤蘭的生物防治方法，我們對白三葉草的植物內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物進行了研究?，F(xiàn)從白三葉草中分離得到一株真菌，經(jīng)形態(tài)及18s RNA測序，鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，采用大米固體培養(yǎng)基發(fā)酵，其乙酸乙酯提取物具有抑制種子發(fā)芽的能力，因此，我們對其進行了化學(xué)成分的研究，分離得到了四個生物堿化合物，經(jīng)理化性質(zhì)與波譜測試，鑒定為:pyripyropene A(1)、verruculogen(2)、fumigaclavine C(3)、fumiquinazoline J(4)，其中化合物1～3采用鈣流模型測試了它們的生物活性，但結(jié)果顯示:化合物1～3均無促進鈣離子細胞內(nèi)流的活性。

現(xiàn)代研究認為煙曲霉是引起人類肺部感染非常重要的一種曲霉菌，有從泥土［4］、海洋［5］、植物［6］中分離得到的報到。到目前為止，分離得的代謝產(chǎn)物至少有226個［7］，許多具有很強的生物活性，例如，pyripyropene A［8］為乙酰輔酶A:膽甾醇乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，具醫(yī)療應(yīng)用價值，因此，白三葉草植物內(nèi)生菌煙曲霉及其次生代謝產(chǎn)物在紫莖澤蘭的生物防治及在醫(yī)藥中的應(yīng)用前景還值得我們進一步深入研究。

1 儀器與材料

Bruker AV600 MHz及 Bruker AV400 MHz核磁共振儀(TMS作為內(nèi)標，δ為 ppm，J為 Hz);Xevo TQ-S超高壓三重四極桿質(zhì)譜儀;柱層析用硅膠(200～300目)和薄層層析用硅膠(10～40 μm)，青島海洋化工廠生產(chǎn);Rp-C18硅膠為40～60 μm，由 Daiso公司生產(chǎn);MCI gel CHP 20P為日本三菱公司產(chǎn)品;Sephadex LH-20為GE公司產(chǎn)品;10%H2SO4乙醇溶液為顯色劑。

白三葉草葉片于2010年12月采集于西昌學(xué)院校園，原植物由第一作者鑒定，分離的白三葉草植物內(nèi)生真菌煙曲霉由云南大學(xué)微生物所李文均教授鑒定。

白菜種子(昆玉牌高抗王AC-3F1，云南省昆明市華農(nóng)種業(yè)有限公司)購于昆明市茨壩農(nóng)資店。

2 提取與分離

2.1 植物內(nèi)生菌的分離與鑒定

白三葉草健康新鮮葉片于自來水沖洗洗凈，甩干水，于75%乙醇液中浸泡5 min，取出，再于2%次氯酸鈉溶液中浸泡20 min，取出，無菌水沖洗3～4次，無菌刀將其切成約0.5 ×0.5 cm的小片，貼附于PDA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)至切片邊緣長出菌絲，劃線分離至PDA培養(yǎng)基上的菌落為單一菌落，插片法觀察菌落形態(tài)，18s RNA基因測序鑒定本菌種為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，見圖1。

圖1 煙曲霉孢子的形態(tài)Fig.1 The morphology of Aspergillus fumigatus

2.2 發(fā)酵與提取

采用大米(5 kg)固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，種子培養(yǎng)基為不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，按10% ～20%的接種量接種于大米培養(yǎng)基，待菌絲長滿，乙酸乙酯提取三次，提取液減壓回收溶劑，得浸膏15 g。

2.3 種子發(fā)芽抑制實驗

取0.2 g乙酸乙酯提取物，用2 mL水溶解，各移入1.0 mL放有濾紙的二個培養(yǎng)皿內(nèi)，空白為僅有濾紙的培養(yǎng)皿，蒸餾水潤濕濾紙，每皿中放入子粒飽滿的30粒白菜種子，室溫培養(yǎng)4天，每天觀察，結(jié)果顯示:提取物對白菜種子有明顯的抑制其發(fā)芽的能力。

2.4 分離

浸膏用硅膠拌樣上硅膠柱，切柱，分I～IV個部位，取部位II上凝膠柱，氯仿∶甲醇(3∶2)洗脫，共分七個部位，部位5～7再經(jīng)Sephadex LH-20、反相硅膠、正相硅膠色譜分離純化，最終得化合物1(9.0 mg)、2(6.0 mg)、3(78.5 mg)、4(1.5 mg)，見圖 2。

圖2 化合物1～4的結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compounds 1-4

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色固體(CHCl3-CH3OH);ESI-MS m/z:［M+Na］+606，［2M+Na］+1189，顯示分子量為583;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH:4.80(1H，dd，J=11.5，4.8 Hz，H-1)，1.90(1H，m，H-2a)，1.82(1H，m，H-2b)，2.16(1H，m，H-3a)，1.30(1H，m，H-3b)，1.54(1H，m，H-5)，5.02(1H，m，H-7)，1.63(1H，m，H-8a)，1.77(1H，m，H-8b)，1.61(1H，m，H-9)，3.78(1H，d，J=11.9 Hz，H-11a)，3.71(1H，d，J=11.9 Hz，H-11b)，1.44(3H，s，H-12)，5.01(1H，s，H-13)，2.98(1H，s，13-OH)，1.69(3H，s，H-14)，0.88(3H，s，H-15)，2.04(3H，s，1-O-CO-CH3)，2.16(3H，s，7-O-CO-CH3)，2.09(3H，s，11-O-CO-CH3)，6.46(1H，m，5'-H)，9.00(1H，s，2″-H)，8.09(1H，ddd，J=8.0，2.4，1.8 Hz，4″-H)，7.40(1H，dd，J=8.0，4.8 Hz，5″-H)，8.68(1H，d，J=2.4 Hz，6″-H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δC:73.6(C-1)，22.7(C-2)，36.1(C-3)，37.8(C-4)，54.7(C-5)，83.2(C-6)，77.7(C-7)，25.2(C-8)，45.3(C-9)，40.3(C-10)，64.8(C-11)，17.4(C-12)，60.2(C-13)，16.2(C-14)，13.2(C-15)，21.1(1-O-CO-CH3)，170.6(1-O-CO-CH3)，21.2(7-OCO-CH3)，170.1(7-O-CO-CH3)，20.8(11-O-COCH3)，171.0(11-O-CO-CH3)，164.0(C-2')，102.9(C-3')，162.2(C-4')，99.4(C-5')，157.3(C-6')，146.8(C-2″)，127.1(C-3″)，133.0(C-4″)，123.6(C-5″)，151.5(C-6″)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的pyripyropene A一致［9］，因此鑒定化合物 1為pyripyropene A。

化合物2:白色固體(CHCl3-CH3OH);ESI-MS m/z:［M+Na］+534，［2M+Na］+1045，顯示分子量為511;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH:7.99(1H，d，J=8.0 Hz，H-4)，6.82(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-5)，6.63(1H，d，J=8.0 Hz，H-23)，6.58(1H，d，J=2.0 Hz，H-7)，6.04(1H，d，J=6.4 Hz，H-18)，5.65(1H，d，J=1.0 Hz，H-8)，5.03(1H，m，H-24)，4.74(1H，d，J=1.6 Hz，8-OH)，4.45(1H，m，H-12)，4.04(1H，s，9-OH)，3.84(3H，s，6-OCH3)，3.63(2H，m，H-15)，2.50(1H，m，H-13a)，2.09(2H，m，H-13b，14a)，2.00(1H，m，H-19a)，2.00(3H，s，H-21)，1.97(1H，m，H-14b)，1.73(3H，s，H-26)，1.66(1H，m，H-19b)，1.71(1H，m，H-27)，0.99(3H，s，H-22);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δc:131.6(C-2)，105.5(C-3)，120.9(C-3a)，121.6(C-4)，109.4(C-5)，156.3(C-6)，93.9(C-7)，136.2(C-7a)，68.9(C-8)，82.5(C-9)，166.2(C-11)，58.7(C-12)，29.1(C-13)，22.6(C-14)，51.1(C-15)，170.7(C-17)，48.9(C-18)，45.4(C-19)，82.2(C-20)，25.7(C-21)，27.1(C-22)，85.8(C-23)，118.4(C-24)，143.2(C-25)，18.9(C-26)，24.2(C-27)，55.8(6-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的verruculogen一致［6］，因此鑒定化合物2為verruculogen。

化合物3:白色油狀液體(CHCl3-CH3OH);ESIMS m/z:［M+H］+367，顯示分子量為366;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH:8.56(1H，s，N-H，indole)，7.06(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，6.99(1H，t，J=8.0，8.0 Hz，H-5)，6.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.06(1H，m，H-15)，5.62(1H，s，H-21a)，5.04(1H，s，H-21b)，5.07(1H，t，J=5.6，0.8 Hz，H-20)，3.86(1H，br s，H-14)，3.36(1H，s，H-13)，2.58(4H，m，H-9，12)，2.41(3H，s，11-N-CH3)，1.85(3H，s，CH3CO)，1.48(6H，s，17，18-CH3)，1.30(3H，d，J=7.2 Hz，14-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δC:132.4(C-1)，105.4(C-2)，127.8(C-3)，128.5(C-4)，112.3(C-5)，121.9(C-6)，107.9(C-7)，137.1(C-8)，27.7(C-9)，61.6(C-10)，43.4(C-11)，57.9(C-12)，33.0(C-13)，16.4(C-14)，71.4(C-15)，39.1(C-16)，27.2(C-17)，27.3(C-18)，39.1(C-19)，145.8(C-20)，111.4(C-21)，171.4(15-O-CO-CH3)，21.0(15-O-COCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的fumigaclavine C一致［10］，因此鑒定化合物3為fumigaclavine C。

化合物4:白色固體(CHCl3-CH3OH);1H NMR(600 MHz，CDCl3)δH:8.27(1H，dd，J=6.6，1.2 Hz，H-10)，8.08(1H，s，H-19)，7.72(1H，d，J=7.2 Hz，H-8)，7.62(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.47(1H，d，J=8.4 Hz，H-9)，7.42(1H，d，J=8.4 Hz，H-24)，7.34(1H，d，J=8.4 Hz，H-2)，7.20(1H，d，J=6.0 Hz，H-21)，7.10(1H，d，J=7.2 Hz，H-22)，6.77(1H，s，H-23)，6.10(1H，d，J=1.8 Hz，H-14)，3.57(1H，d，J=1.4 Hz，H-15a)，3.55(1H，d，J=1.4 Hz，H-15b)，2.27(3H，s，CH3-16);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δC:170.0(C-1)，160.3(C-12)，153.1(C-4)，147.0(C-6)，134.8(C-18，C-20)，134.6(C-8)，128.0(C-25)，127.7(C-7，C-9)，127.6 (C-10)，123.7(C-22)，120.9(C-11)，120.8(C-23)，118.6(C-24)，111.4(C-21)，108.0(C-17)，54.9(C-3)，54.7(C-14)，26.2(C-15)，18.4(C-16)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的 fumiquinazoline J一致［5，11］，因此鑒定化合物4 為 fumiquinazoline J。

4 討論

從當前的研究來看，本論文報道的四個生物堿結(jié)構(gòu)特異且均具有較強的生物活性，但化合物1～3通過鈣流模型評價其生物活性的測試結(jié)果卻顯示它們均無促進鈣離子細胞內(nèi)流的活性。

雖然白三葉草植物內(nèi)生真菌煙曲霉的發(fā)酵乙酸乙酯提取物顯示具有抑制白菜種子發(fā)芽的活性，但分離得的四個生物堿的量少，未能進一步評價其是否就是其化感作用的活性物質(zhì)，以及能否抑制紫莖澤蘭的生長，這些工作擬將在以后的工作中繼續(xù)開展。

1 Ross SM，King JR，Cesar Izaurralde R，et al.Weed suppression by seven clover species.Agron J，2001，93:820-827.

2 Zhang XF(張曉芳)，Wang JX(王金信)，Xie N(謝娜)，et al.Allelopathic effects of Trifolium repens volatile and its chemical components.Acta Phytophy Sin(植物保護學(xué)報)，2011，38:374-378.

3 Wang LH(王莉衡).Research advance on plant endophyte.Chem Bioeng(化學(xué)與生物工程)，2011，28(3):5-7.

4 Wang SL，Chen YH，Wang CL，et al.Purification and characterization of a serine protease extracellularly produced by Aspergillus fumigatus in a shrimp and crab shell powder medium.Enzyme Microb Technol，2005，36:660-665.

5 Han XX(韓小賢)，Xu XY(許曉妍)，Cui CB(崔承彬)，et al.Alkaloidal compounds produced by a marine-derived fungus，Aspergillus fumigatus H1-04，and their antitumor activities.Chin J Med Chem(中國藥物化學(xué)雜志)，2007，14:232-237.

6 Zhou F(周鳳)，Zhang HC(張弘弛)，Liu R(劉瑞)，et al.I-solation and biological evaluation of secondary metabolites of endophytic fungus Aspergillus sp.from Astragalus membranaceus.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2012，18:125-128.

7 Jens CF，Christian R，Kristian FN，et al.Metabolomics of Aspergillus fumigatus.Med Mycol，2009，47:S53-S71.

8 Tomoda H，Kim YK，Nishida H，et al.Pyripyropenes，novel inhibitors of Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by aspergillus fumigatus I.production，isolation，and biological properties.J Antibiot，1994，47:148-153.

9 Kim YK，Tomoda H，Nishida H，et al.Pyripyroenes，novel inhibitors of Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase produced by aspergillus fumigatus II.structure elucidation of pyripyropenes A，B，C，D.J Antibiot，1994，47:154-162.

10 Cole RJ，Kirksey J，Dorner JW，et al.Mycotoxins produced by Aspergillus fumigatus species isolated from molded silage.J Agric Food Chem，1977，25:826-830.

11 Zhang LM(張麗敏)，Li ZL(李占林)，Bai J(白皎)，et al.Metabolites of Aspergillus sp.HT-2.Chin Pharm J(中國藥學(xué)雜志)，2011，46:1154-1158.