MG63細(xì)胞驗(yàn)證無鎳不銹鋼生物相容性的研究

馬天馳，李濟(jì)強(qiáng)，劉繼輝，王良宇

(1.沈陽市口腔醫(yī)院正畸科，遼寧 沈陽 110002;2.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)

臨床中對由于外傷、腫瘤、畸形修復(fù)等所導(dǎo)致骨組織缺損的修復(fù)多采用骨移植或利用醫(yī)用金屬材料制作的贗復(fù)體來修復(fù)。相對于骨移植，醫(yī)用金屬材料在強(qiáng)度、彈性、可塑性、加工難易程度、制作成本、對于醫(yī)療設(shè)備的要求、患者的經(jīng)濟(jì)承受能力方面有著巨大的優(yōu)勢，故已經(jīng)成為臨床上廣泛應(yīng)用的材料之一［1－5］。常見的醫(yī)用金屬材料包括不銹鋼 (尤其是AISI 316L和317L)，CoCrMo合金以及鈦合金等。傳統(tǒng)醫(yī)用不銹鋼中具有較高的鎳含量 (通常為10% ～14%)，植入人體后由于電化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致鎳離子溶出而可能引發(fā)致畸、致敏等毒性反應(yīng)。在此背景下，無鎳不銹鋼 (nickel－free stainless steel) 隨之發(fā)展起來［6－9］。

良好的生物相容性是決定生物材料能否應(yīng)用于臨床的先決條件之一，本文采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法來考察成骨細(xì)胞在材料上的生長狀況及復(fù)合生長的細(xì)胞是否具有正常的生理功能，對三種不同醫(yī)用金屬材料 (無鎳不銹鋼、317L不銹鋼和CoCrMo合金)的細(xì)胞相容性進(jìn)行研究，來評價(jià)無鎳不銹鋼作為口腔骨科植入材料的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 金屬材料制備 使用中國科學(xué)院金屬研究所提供的無鎳不銹鋼 (0Cr18Mn15Mo2N0.64)，醫(yī)用317L不銹鋼以及 CoCrMo合金。所有樣品經(jīng)過1 100℃固溶處理1 h，切取10 mm×10 mm×1 mm的薄片，用SiC砂紙水磨至1200#，成邊緣光滑、無銳角的薄片，依次在丙酮、酒精和蒸餾水中超聲清洗20 min后干燥，制得實(shí)驗(yàn)用樣品。

1.2 MG63細(xì)胞培養(yǎng) MG63細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液(Hyclone USA)加10%胎牛血清(Hyclone USA)(含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)于37℃，濕度100%，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞每2 d換液，每4 d傳代，傳代比例為1∶4。待細(xì)胞數(shù)量足夠后備用。

1.3 細(xì)胞體外培養(yǎng) 將預(yù)先無菌處理好的無鎳不銹鋼、317L不銹鋼和CoCrMo合金放入6孔板。取MG63細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基 (含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L的β－磷酸甘油、0.2 mmol/L的維生素C、100 U/ml的青霉素、100 U/ml的鏈霉素和10%胎牛血清)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，在每個(gè)材料表面滴加0.5 ml細(xì)胞懸液，并保證不讓材料表面液滴流到板底 (由于所有材料的表面積是相同的，所以每片材料上滴加相同體積、相同細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液，使其上種植的細(xì)胞數(shù)相等)，放入培養(yǎng)箱連續(xù)孵育12 h，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，無菌PBS溶液沖洗3次，每個(gè)孔內(nèi)再加入2.5 ml成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)，期間不換代。

1.4 細(xì)胞黏附率檢測 將MG63細(xì)胞種植于無鎳不銹鋼、317L不銹鋼和CoCrMo合金表面12 h，使得細(xì)胞黏附在材料表面。隨后棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS溶液輕輕沖洗3次以去除沒有附著的細(xì)胞。黏附在材料表面的細(xì)胞用含0.25%胰消化酶的PBS溶液消化下來并計(jì)數(shù)，計(jì)算每種金屬表面的細(xì)胞黏附率。

1.5 細(xì)胞增殖率檢測 將MG63細(xì)胞用胰蛋白酶從培養(yǎng)瓶中消化下來，以1 000 r/min離心，去上清液，礦化培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度到1×104/cm2接種于每種金屬表面，分別取1、3、5 d培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測。

1.6 金相顯微鏡觀察 在細(xì)胞接種的1、5 d，分別取出樣品用PBS溶液輕輕沖洗3次，用4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定過夜，然后用PBS溶液輕輕沖洗2遍，再逐級 (50%、75%、95%、100%)酒精脫水，每個(gè)濃度脫水2次，每次10 min，冷凍干燥。在金相顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和形態(tài)。

1.7 堿性磷酸酶活性檢測 將細(xì)胞種植于材料表面1、3和5 d，取出用PBS溶液輕輕沖洗3次，在4℃環(huán)境下用0.01%TritonX－100裂解細(xì)胞12 h，然后用吸管反復(fù)吹打1 min，使細(xì)胞充分碎解。以14 000 r/min離心5 min，吸取一部分上清液并用對硝基苯磷酸鹽 (即PNPP)法檢測堿性磷酸酶，另一部分上清液用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行檢驗(yàn)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在判斷數(shù)據(jù)是正態(tài)分布 (在偏度和峰度上t分布的檢驗(yàn)值＜1.96)的前提下，采用One－Way ANOVA評價(jià)整體性差異，方差齊性用LSD t－test分析方法進(jìn)行組間比較，方差不齊用Dunnett T3分析方法進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 材料表面細(xì)胞黏附率 經(jīng)過12 h培養(yǎng)，MG63細(xì)胞在無鎳不銹鋼表面細(xì)胞黏附率為95.22±2.01，高于 317L不銹鋼 (80.42±1.72)和CoCrMo合金 (80.35±1.05)(P＜0.05)，顯示了細(xì)胞在無鎳不銹鋼材料表面良好的黏附能力。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 圖1顯示在金屬表面培養(yǎng)1 d細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞單個(gè)或成集落生長，細(xì)胞圓形或多角形。圖2顯示在培養(yǎng)5 d細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞成片生長，細(xì)胞形態(tài)不易區(qū)分。

2.3 細(xì)胞增殖率檢測 3種金屬表面MG63細(xì)胞生長1 d吸光度值差異無顯著性。3 d和5 d時(shí)無鎳不銹鋼吸光度值與317L不銹鋼和CoCrMo合金比較差異有顯著性 (P＜0.05和0.01)。見表1。

表1 3種金屬表面MG63細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果 (OD值)

2.4 堿性磷酸酶的活性檢測 1 d時(shí)3種金屬表面堿性磷酸酶活性差異無顯著性，3 d和5 d時(shí)無鎳不銹鋼的堿性磷酸酶活性高于另外2種金屬，差異有顯著性 (P＜0.05)。見表2。

表2 3種金屬表面堿性磷酸酶的活性檢測結(jié)果(金氏單位U/gprot)

3 討論

交通事故所導(dǎo)致的口腔頜面部的外傷，腫瘤切除后，原發(fā)性和繼發(fā)性畸形修復(fù)可導(dǎo)致骨組織的缺損，使軟組織失去了支持，導(dǎo)致組織塌陷，影響形態(tài)和功能。臨床中對于此類骨組織的缺損的修復(fù)除采用骨移植外，利用醫(yī)用金屬材料制作的贗復(fù)體來修復(fù)也是臨床實(shí)踐中常用的一種方法。由于醫(yī)用金屬材料在強(qiáng)度、彈性、可塑性、加工難易程度、制作成本、對于醫(yī)療設(shè)備的要求?；颊叩慕?jīng)濟(jì)承受能力方面有著巨大的優(yōu)勢，故已經(jīng)在臨床中植入以代替硬組織行使功能。

以AISI 316L和317L為代表的醫(yī)用奧氏體不銹鋼，由于其優(yōu)良的力學(xué)性能和抗腐蝕性能被廣泛應(yīng)用于骨科和心血管支架等外科植入物，但是其中都含有14%左右的鎳元素。由于在人體環(huán)境中不可避免的腐蝕行為，現(xiàn)有醫(yī)用不銹鋼會存在鎳離子溶出而導(dǎo)致潛在的致敏和毒性危害，因此新型的無鎳奧氏體不銹鋼得到快速發(fā)展和應(yīng)用。

目前世界各國的研究者都在進(jìn)行醫(yī)用無鎳不銹鋼的研究和開發(fā)。Yamamoto等［10］通過高溫滲氮得到了Fe－Cr－Mo－N 的無鎳高氮不銹鋼，在研究了與316L和 Fe－24Cr－2Mo不銹鋼的細(xì)胞毒性對比，結(jié)果表明滲氮后形成的醫(yī)用無鎳不銹鋼具有更好的細(xì)胞相容性。Wan等［11］的研究表明，高氮無鎳不銹鋼的血液相容性要優(yōu)于317L不銹鋼，并且隨著氮含量的上升，血液相容性得到明顯改善。Montanaro等［12］研究了P558無鎳奧氏體不銹鋼植入綿羊脛骨后和骨組織的反應(yīng)，組織相容性與Ti－6Al－4V合金相當(dāng)，明顯優(yōu)于316L不銹鋼。目前美國已將無鎳奧氏體不銹鋼作為外科植入材料列入到ASTM標(biāo)準(zhǔn)中 (ASTM F2229－02)。

本實(shí)驗(yàn)將無鎳不銹鋼和317L、CoCrMo合金并列將以比較，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選用MG63細(xì)胞。MG63細(xì)胞是一種成骨前體細(xì)胞，分離于青少年骨肉瘤。常常用來體外關(guān)于成骨誘導(dǎo)，生物材料生物相容性等方面的研究。通過測定細(xì)胞黏附率、金屬表面的細(xì)胞增殖率、堿性磷酸酶活性，從而比較3種金屬的生物相容性的差別。對于細(xì)胞黏附率，3種金屬表面的細(xì)胞黏附率差異有顯著性，其中，無鎳不銹鋼高于317L不銹鋼和CoCrMo合金，即植入后的細(xì)胞黏附良好，在此方面的生物相容性無區(qū)別。MTT檢測的細(xì)胞增殖率，量化細(xì)胞增殖率的不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在無鎳不銹鋼表面的細(xì)胞增殖最好，即細(xì)胞的生長狀態(tài)良好。堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果也顯示在無鎳不銹鋼表面的細(xì)胞成骨分化能力最好。

從以上實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)無鎳不銹鋼具有良好的體外生物相容性，優(yōu)于傳統(tǒng)的醫(yī)用317L和CoCrMo合金，有良好的臨床應(yīng)用前景。

［1］俞耀庭，張興棟.生物材料［M］.天津：天津大學(xué)出版社，2000：27.

［2］Gustiio RB，Merkow RL，Templemun D.The management of open fracture［J］.Bone Joint Surg Am，1990，72(2)：299－304.

［3］Ratner BD.生物材料學(xué)：醫(yī)用材料簡介［M］，San Diego CA：學(xué)術(shù)出版社，1996：98.

［4］Black J，Hastings G.Handbook of biomaterial properties［M］.London：Chapman＆ Hall，1998：77.

［5］Mitsuo N.Recent metallic materials for biomedical applications［J］.Metal Materi Trans，2002，33A：477.

［6］Stein G，Menzel J.Nitrogen alloyed steels－a new generation of materials with extraordinary properties［J］.Intern J Materials and Product Technol(Switzerland)，1995，10(3－6)：290－302.

［7］Montanaro L，Cervellati M，Campoccia D，et al.No genotoxicity of a new nickel－free stainless steel［J］.Int J Artif Organs，2005，28(1)：58－65.

［8］Fini M，Aldini N，Torricelli P，et al.A new austenitic stainless steel with negligible nickel content：an in vitro and in vivo comparative investigation［J］.Biomaterials，2003，24(27)：4929 －4939.

［9］Fini M，Giavaresi G，Giardino R，et al.A new austenitic stainless steel with a negligible amount of nickel：an in vitro study in view of its clinical application in osteoporotic bone［J］.J Biomed Mater Res，2004，71B：30－37.

［10］Yamamoto A，Kohyama Y，Kuroda D，et al.Cytocompatibility evaluation of Ni－free stainless steel manufactured by nitrogen adsorption treatment［J］.Mate Sci Eng，2004，24(6 －8)：737 －743.

［11］Wan P，Ren YB，Zhang BC，et al.Effect of nitrogen on blood compatibility of nickel－free high nitrogen stainless steel for biomaterial［J］.Mater Sci Eng，2010，30：1183 －1189.

［12］Lucio Montanaro，Marina Cervellati，et al.Promising in vitro performances of a new nickel－free stainless steel ［J］.Materials in Medicine，2006，17：267－275.