黃連多糖提取、分離純化鑒定及清除羥基自由基能力測定

王 偉，劉世軍，安法娥，張良栓

(1 武警山東總隊(duì)醫(yī)院，濟(jì)南 250014;2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

黃連多糖是從黃連根莖中提取的一種有機(jī)物質(zhì)，具有與黃連相似的藥理作用，能有效抑制α-淀粉酶對可溶性淀粉的降解，其活性優(yōu)于降糖藥物阿卡波糖(拜糖平)［1］。黃連作為常用的降血糖藥物，其活性成分為小檗堿類生物堿。研究證明，多糖是黃連的重要組分［2，3］。多糖的降糖作用多歸因于其具有良好的抗氧化能力。2012年1～6月，我們從雞爪黃連的根莖中提取黃連多糖，并觀察其結(jié)構(gòu)及清除羥基自由基的能力，進(jìn)一步探討其降糖作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、纖維素酶購自美國 Sigma公司，鄰二氮菲、DEAE-52纖維素、Sephadex G-100購自 Sinopbarm Chemical Reagent Co.Ltd，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。恒溫培養(yǎng)箱、UV-2550紫外可見分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)、6511-型電動(dòng)攪拌機(jī)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、AL104電子天平、溴化鉀壓片機(jī)、離心機(jī)。

1.2 黃連多糖制備及鑒定

1.2.1 黃連多糖制備［4］稱取粉碎至20目的黃連粗粉120 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，5倍無水乙醇回流脫脂4 h。濾渣干燥后，加入10倍0.1 mmol/L NaOH溶液，80℃水浴回流提取1 h。提取液調(diào)至中性，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至300 mL。向濃縮液中加纖維素蛋白酶0.06 g，40℃水浴2 h。按Sevag法，配制比例為提取液∶氯仿∶正丁醇 =25∶5∶1，電動(dòng)攪拌 20 min 后，于 4000 r/min 離心 5 min，靜置分層，棄去有機(jī)層。依此法除4次蛋白。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除剩余正丁醇和氯仿，加無水乙醇沉淀得粗多糖。分別用DEAE纖維素色譜柱和Sephadex G-100色譜柱將再次溶解的粗多糖進(jìn)行分離純化，最終得到純化黃連多糖，分別命名為CFPⅠ、CFPⅡ。

1.2.2 黃連多糖鑒定

1.2.2.1 洗脫曲線 樣品 CFPⅠ、CFPⅡ過 Sephadex G-100凝膠柱，為單一色譜峰，峰形對稱，證明CFPⅠ、CFPⅡ均為均一組分。見圖1。

1.2.2.2 紫外圖譜掃描 配置1 mg/mL CFPⅠ、CFPⅡ溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)，掃描各多糖紫外吸收。兩種多糖在260 nm及280 nm處無吸收峰，成分中無核酸及蛋白質(zhì)。見圖2。

圖1 黃連多糖的DEAE-52及Sephadex G-100洗脫曲線

1.2.2.3 紅外圖譜掃描 采用溴化鉀壓片法測定多糖結(jié)構(gòu)［5］。兩種多糖樣品在3000～3500 cm-1處有強(qiáng)吸收，提示有多糖分子間或分子內(nèi)氫鍵;分別在2936和2932 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，為糖鏈中次甲基(-CH2-)CH-伸縮振動(dòng)引起，在這個(gè)區(qū)域的兩組吸收峰是糖類的特征峰。兩種多糖樣品分別在1624和1616 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，可能為-COOH、-CO-或C=O非對稱伸縮振動(dòng)峰。1447和1406 cm-1處強(qiáng)吸收峰為-COOH的C-O引起的吸收峰，提示可能存在糖醛酸，經(jīng)硫酸咔唑法驗(yàn)證確有糖醛酸存在。1337和1358 cm-1處吸收峰分別為兩多糖的-OH變形振動(dòng)說明該組分為多聚糖。在CFPⅡ樣品中，1233 cm-1處特征吸收表明，CFPⅡ中可能含有硫酸基。1142和1102 cm-1處為吡喃環(huán)的C-OC環(huán)內(nèi)伸縮振動(dòng)特征吸收。CFPⅠ樣品中，876 cm-1處吸收可能為β-D-葡萄吡喃糖吸收峰，840 cm-1處吸收可能為α-D-半乳吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖或α-D-甘露吡喃糖吸收峰;在CFPⅡ樣品中，895 cm-1處可能為β-D-甘露吡喃糖吸收峰。見圖3。

圖2 黃連多糖紫外圖譜掃描結(jié)果

1.2.3 黃連多糖能力測試

1.2.3.1 還原能力 采用普魯士蘭法［6］。分別配置濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL 的樣品及對照品10 mL。取試樣2.5 mL，加入 pH 為6.6的0.2 mol/L磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混合均勻，混合液50℃保溫20 min后加入10%三氯乙酸 2.5 mL，混勻后取該溶液 2.5 mL，再加入去離子水2.5 mL 和 0.1%FeCl30.5 mL，混合均勻10 min后于700 nm處測定吸光度(A)，以維生素C(Vc)及葡萄糖醛酸作為陽性對照(臨用前以去離子水配制)。吸光度A=Ai-Aj，Ai為試樣吸光值，Aj為去離子水代替試樣的吸光度值，以多糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

圖3 黃連多糖紅外光譜掃描結(jié)果

1.2.3.2 對羥基自由基的清除能力 將鄰二氮菲(0.75 mmol/L，1.0 mL)，F(xiàn)eSO4(0.75 mmol/L，0.5 mL)，PBS 緩沖液(pH 7.4，50 mmol/L，1 mL)混合，加黃連多糖后加 H2O2(0.1%，0.5 mL)溶液，用去離子水補(bǔ)至10 mL，37℃保溫1 h，于510 nm處測定吸光度(A)值，葡萄糖醛酸及Vc為陽性對照，測定表觀羥基自由基清除率d。公式為:d=［A(加藥)-A(損傷)］/［A(未損傷)-A(損傷)］×100%。其中，A(加藥)為體系中加入黃連多糖或陽性對照組的吸光度值;A(損傷)為體系中不加黃連多糖或陽性對照組的吸光度值;A(未損傷)為體系中不加黃連多糖或陽性對照組和H2O2的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Origin7.5軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用配對t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連多糖的還原能力 在對照品和黃連多糖中，隨著黃連多糖CFPⅡ、CFPⅠ濃度的增大吸光度逐漸增大。在測定濃度范圍內(nèi)，黃連多糖CFPⅡ、CFPⅠ的還原能力均弱于Vc的還原能力，但強(qiáng)于對照品葡萄糖醛酸。黃連多糖樣品還原能力CFPⅡ強(qiáng)于 CFPⅠ(P ＜0.05)。見圖4。

圖4 黃連多糖還原能力測定結(jié)果

2.2 黃連多糖清除羥基自由基的能力 Vc和葡萄糖醛酸的 IC50值分別為4.17 mg/mL和3.88 mg/mL。而黃連多糖兩個(gè)樣品在最大測量濃度下的清除率均小于50%，黃連多糖樣品對羥基自由基的清除能力CFPⅡ強(qiáng)于CFPⅠ(P＜0.05)。濃度在0.1～2.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，黃連多糖CFPⅡ?qū)αu基自由基的清除能力與對照品葡萄糖醛酸接近(P＞0.05)。濃度為5 mg/mL時(shí)，葡萄糖醛酸對羥基自由基的清除能力明顯強(qiáng)于Vc對照品(P＜0.05)。見圖5。

圖5 黃連多糖羥基自由基清除能力測定結(jié)果

3 討論

氧化應(yīng)激狀態(tài)是產(chǎn)生糖尿病及其并發(fā)癥的主要原因之一。羥基自由基在氧化應(yīng)激中起主要作用，是毒性及氧化性最強(qiáng)的氧自由基。多糖類藥物可以通過清除羥基自由基而抑制氧化應(yīng)激，從而治療糖尿病及其并發(fā)癥［7］。然而不是所有的碳水化合物都具有抗氧化活性。多糖的抗氧化活性與多糖的結(jié)構(gòu)、分子量及單糖的種類和連接方式有關(guān)［8］。黃連自古以來就被用于糖尿病的治療，以往認(rèn)為是黃連中的小檗堿類成分在起作用，而忽視了多糖的作用。本研究中，我們從雞爪黃連根莖的干燥粉末中提取分離出兩種均一的黃連雜多糖，經(jīng)檢測兩種多糖具有較好的清除羥基自由基能力。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連多糖中含有糖醛酸、硫酸基等成分，推測黃連多糖的清除羥基能力可能與糖醛酸有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩種多糖樣品在3000～3500 cm-1處有強(qiáng)吸收，提示有多糖分子間或分子內(nèi)氫鍵;分別在2936和2932 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，為糖鏈中次甲基(-CH2-)CH-伸縮振動(dòng)引起，在這個(gè)區(qū)域的兩組吸收峰是糖類的特征峰。1447和1406 cm-1處強(qiáng)吸收峰為-COOH的C-O引起的吸收峰，提示可能存在糖醛酸，經(jīng)硫酸咔唑法驗(yàn)證確有糖醛酸存在。1337和1358 cm-1處吸收峰分別為兩多糖的-OH變形振動(dòng)，說明該組分為多聚糖。在CFPⅡ樣品中，1233 cm-1處特征吸收表明，CFPⅡ中可能含有硫酸基。1142和1102 cm-1處為吡喃環(huán)的CO-C環(huán)內(nèi)伸縮振動(dòng)特征吸收。CFPⅠ樣品中，876 cm-1處吸收可能為 β-D-葡萄吡喃糖吸收峰，840 cm-1處吸收可能為α-D-半乳吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖或α-D-甘露吡喃糖吸收峰;在CFPⅡ樣品中，895 cm-1處吸收可能為β-D-甘露吡喃糖吸收峰。通過還原力測定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Vc還原能力最強(qiáng)，黃連多糖樣品均具有較強(qiáng)的還原能力，而葡萄糖醛酸的還原能力很弱。但在羥基自由基清除能力測定中，0～2 mg/mL濃度范圍內(nèi)Vc清除自由基的能力最強(qiáng)，葡萄糖醛酸及黃連多糖CFPⅡ同樣具有較好的清除能力，濃度為5 mg/mL時(shí)葡萄糖醛酸的清除羥基自由基的能力最強(qiáng)，提示葡萄糖醛酸清除羥基自由基的原理與Vc清除羥基自由基的原理可能不同。Vc不僅有抗氧化作用，也具有促氧化作用，此作用與其烯醇式結(jié)構(gòu)有關(guān)。Vc烯醇式的羥基具有酸性，在過渡離子(尤其是鐵和銅)存在下，會(huì)產(chǎn)生羥基自由基，但Vc在清除羥基自由基的同時(shí)又會(huì)產(chǎn)生半脫氫抗壞血酸負(fù)離子自由基，當(dāng)其不能被及時(shí)清除時(shí)，則可誘發(fā)一系列自由基連鎖反應(yīng)。我們推測葡萄糖醛酸的清除自由基能力可能來自于羧基，羥基自由基具有很強(qiáng)的氧化性，可以使羧基斷裂，從而清除羥基自由基。據(jù)報(bào)道多糖中硫酸基也有一定的清除自由基的能力，因此我們認(rèn)為在黃連多糖CFPⅡ清除羥基自由基的過程中，硫酸基可能起到了一定的作用。

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