大蒜果聚糖水解酶全長(zhǎng)cDNA的克隆

何林乾，黃雪松

(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品系，廣東廣州510000)

果聚糖(fructan)廣泛存在于植物中，是由蔗糖與一個(gè)或多個(gè)果糖分子聚合而成的多聚體。研究表明，果聚糖是高等植物中一類重要的貯存物質(zhì)或滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以提高植物的抗逆性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高等植物中的果聚糖的類型包括:菊糖型果聚糖，由β－2，1糖苷鍵連接;梯牧草型果聚糖，由β－2，6 糖苷鍵連接［1－2］;混合型果聚糖，是前兩種果聚糖的混合體，含分支。根據(jù)經(jīng)典模型［3］，果聚糖水解酶(FEH)主要負(fù)責(zé)果聚糖水解。大蒜(Allium sativum L.)中含有多種形式的果聚糖，這種果聚糖形式的多樣性預(yù)示著大蒜中存在果聚糖的合成和分解兩種相反的生物代謝過程［4－5］。1－果聚糖水解酶(1－FEH)主要負(fù)責(zé)菊糖型果聚糖(inulin)的水解，已經(jīng)在大蒜的鱗莖中分離出具有這種活性的1－FEH［6］。不同植物物種中的FEHs已被克隆和分析:菊科如Vernonia herbacea(一種生于巴西的菊科植物)［7］、H.tuberosus(菊 芋)、Cichorium intybus(菊 苣)［8］;禾 本 科 如Triticum aestivum(小 麥)［9－10］、Lolium perenne(黑 麥草)［11］、Bromus pictus(雀麥屬)［12］、Beta vulgaris L.(甜菜)［13］、Arctium lappa(牛蒡)［14］。這幾種植物 FEH 純品都是通過cDNA克隆與測(cè)序的方法獲得FEH基因后，再于畢赤酵母等微生物中表達(dá)，經(jīng)過分離純化獲得的。而對(duì)于大蒜果聚糖酶的研究，僅有關(guān)于大蒜果聚糖外切酶的一些酶學(xué)特征的研究。而利用基因工程的方法克隆并表達(dá)大蒜FEH的基因的報(bào)道，國(guó)內(nèi)外尚未見到。研究大蒜水解酶，及大蒜中果聚糖［EC3.2］的含量，有重要的商業(yè)價(jià)值和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)的目的在于克隆出大蒜中 FEH的cDNA，并分析其功能，以為進(jìn)一步研究FEH基因在果聚糖代謝中的表達(dá)情況、FEH在貯存保鮮或加工的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜(Allium sativum L.)山東金鄉(xiāng)產(chǎn)，購(gòu)于廣州市石牌農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);感受態(tài)大腸桿菌DH5α、PMD－19 T Vector 均購(gòu)自 TaKaRa公司;RNAiso Plus、PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq、DNA Marker、3'－Full RACE Core Set Ver.2.0、5'－Full RACE Kit 寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;苯酚、氯仿、異丙醇、乙醇等 為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?液氮。

PCR儀 德國(guó)Eppendorf AG;核酸蛋白測(cè)定儀德國(guó)Eppendorf AG;JY600+電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SHA－B水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜總RNA的提取 切取15～30mg超低溫凍結(jié)的大蒜鱗莖組織，迅速轉(zhuǎn)移至－80℃預(yù)冷的研缽中研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀后，加入適量RNAiso Plus，再依次使用氯仿、異丙醇抽提，RNA沉淀用75%的乙醇清洗后溶于RNase－free水中，保存于－80℃。

檢測(cè)RNA的純度和完整性。測(cè)定所獲RNA樣品的OD260和OD280以及2.0%凝膠電泳凝膠判斷RNA的純度和完整性。

1.2.2 合成cDNA第一條鏈 根據(jù)試劑盒PrimeScriptⅡ1st Strand c DNA Synthesis Kit的方法，以獲得的 RNA為模板，以 oligo(dT)為引物，合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 大蒜FEH基因的中間片段的擴(kuò)增 根據(jù)已知的高等植物FEH基因的保守氨基酸序列NWMNDPNGPM和WECPDF設(shè)計(jì)引物 Gl－FEHa、Gl－FEHb(表1)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件為:94℃預(yù)變性 5min;94℃ 30s，50℃ 30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。用Ex Tag DNA合成酶。

將PCR產(chǎn)物克隆到PMD－19 T載體上，并利用感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性篩選。提取質(zhì)粒純化。對(duì)插入的DNA序列送上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序序列命名為DegeFEH－16。

1.2.4 c DNA全長(zhǎng)擴(kuò)增 利用c DNA末端擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲取大蒜果聚糖的cDNA全長(zhǎng)。5'RACE擴(kuò)增:根據(jù)已獲得的DegeFEH－16的 DNA序列，設(shè)計(jì)引物 CTF333 R2、CTF333 R3(表1)。按照TaKaRa 5'－Full RACE Kit試劑盒說(shuō)明，將處理好的Total RNA與 5'Adaptor連接后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)設(shè)立M－MLV(－)對(duì)照。用CTF333 R2與5'RACE Outer Primer進(jìn)行 Outer PCR，用 CTF333 R3與5'RACE Inner Primer進(jìn)行Inner PCR。PCR條件為:94℃預(yù)變性 3min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。

3'RACE擴(kuò)增:根據(jù)已經(jīng)獲得的DegeFEH－16的DNA序列，設(shè)計(jì)引物 CTF333 F1、CTF333 F3(表1)。Total RNA 與 3'Adaptor后，，使用 TaKaRa 3'－Full RACE Core Set Ver.2.0將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)設(shè)立M－MLV(－)對(duì)照。用 CTF333 F1與3'RACE Outer Primer進(jìn)行 Outer PCR，用 CTF333 F3與 3'RACE Inner Primer進(jìn)行 Inner PCR。PCR條件為:94℃預(yù)變性 3min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。

經(jīng)RACE擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物均進(jìn)行切膠回收，并使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0中的連接酶，將回收產(chǎn)物與pMD20－T Vector連接，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列拼接、RACE序列驗(yàn)證 將獲得的ORF部分序列、5'序列和3'序列用DNAstar分析軟件進(jìn)行全長(zhǎng)拼接。根據(jù)得到的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)并合成引物CTF333 F5、CTF333 R8(表 1)，用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 序列結(jié)構(gòu)分析及同源性分析 應(yīng)用SignalP 3.0Server和ExPASy等對(duì)cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行序列分析，包括尋找ORF，推導(dǎo)編碼氨基酸序列、預(yù)測(cè)信號(hào)肽及其保守結(jié)構(gòu)域。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

將所獲得的大蒜FEH基因的cDNA序列及編碼的氨基酸序列放入NCBI的GenBank中進(jìn)行BLAST，分析其和已收錄植物FEH的同源性。用軟件Clustal X和MEGA 4.0程序中的鄰接法(Neighbor－Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果檢測(cè)

提取大蒜總RNA進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。從電泳結(jié)果看，總RNA的28s和18s兩條帶較為清晰，表明RNA降解不嚴(yán)重，完整性較好。檢測(cè)總RNA樣品A260/A280為2.04，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。綜合以上檢測(cè)結(jié)果，提取的RNA可以用于反轉(zhuǎn)錄。

圖1 總RNA的瓊脂糖電泳凝膠Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.2 中間片段DegeFEH－16的PCR結(jié)果

經(jīng)過PCR得到大小在500～750bp之間的中間片段(圖2)，經(jīng)質(zhì)粒測(cè)序，得到569bp的基因序列。將序列在NCBI中 BLAST檢索，該序列與已收錄的FEH序列有高度同源性。

2.3 3'RACE結(jié)果

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)后，將反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖3A)。經(jīng)質(zhì)粒測(cè)序得到1134bp的3'端未知序列。

2.4 5'RACE結(jié)果

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)后，將反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖3B)。經(jīng)質(zhì)粒測(cè)序得到185bp的5'端未知序列。

圖2 DegeFEH－16的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DegeFEH－16

圖3 RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of product of RACE

2.5 cDNA全長(zhǎng)拼接和RACE序列驗(yàn)證

將利用PCR得到的中間基因序列和通過RACE PCR方法獲得的3'和5'端序列，用DNAStar軟件拼接，獲得了全長(zhǎng)1900bp的序列，序列為(陰影部分是CDS區(qū)):

用引物CTF333 F5和CTF333 R8進(jìn)行PCR驗(yàn)證RACE的結(jié)果，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳(圖3C)。經(jīng)驗(yàn)證，得到的5'和3'序列是根據(jù)已知序列得到的。

2.6 cDNA全長(zhǎng)序列分析、同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用DNAstar將獲得的全長(zhǎng)基因序列翻譯成氨基酸序列為:

經(jīng)ExPASy軟件在線分析計(jì)算，所獲序列全長(zhǎng)1900bp，編碼區(qū)(CDS 區(qū))位于 33～1700bp，共編碼555個(gè)氨基酸，信號(hào)肽的長(zhǎng)度是27個(gè)氨基酸。其編碼蛋白分子量和等電點(diǎn)pI分別為63453u和5.79。

將已獲得的氨基酸序列與GenBank中已收錄的其它高等植物FEH氨基酸序列相比對(duì)，該序列與禾本科植物的有較高的同源性，與小麥 FEH(BAE44509.1)同源性為53%，與黑麥(AAZ29514.1)的同源性為 52%。另外，與石刁柏(Asparagus officinalis)的一種細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(BAF93492.1)同源性為64%，與石刁柏的6－酮糖水解酶(BAF93491.1)同源性為62%。

用軟件Clustal X比對(duì)所獲的氨基酸序列與其他植物的FEH氨基酸序列，所獲序列含有保守氨基酸序列WMNDP、RDP和WECVD。(圖4)

圖4 大蒜和其他已知高等植物的FEH的保守氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison of deduced amino－acid sequence of FEH from Allium sativum L.with FEHs reported from other plants

用MEGA 4.0程序中的鄰接法(Neighbor－Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。

圖5 基于大蒜和其他已知高等植物的FEH的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic analysis ofAllium sativum L.FEH with related FEH

3 結(jié)論

3.1 如上所述，我們獲得的cDNA序列全長(zhǎng)1900bp，含1668bp的CDS區(qū)，編碼555個(gè)氨基酸的多肽鏈，經(jīng)ExPASy軟件分析預(yù)測(cè)其蛋白分子量為63453u，該分子量與已報(bào)道的、經(jīng)SDS－PAGE測(cè)得大蒜1－FEH的分子質(zhì)量［6］、即61700u基本一致。

3.2 本文所獲得的氨基酸序列中，包含WMNDP、RDP和WECVD三個(gè)保守氨基酸序列，與已知的菊苣、牛蒡、黑麥及小麥等植物的FEH中的保守序列基本吻合。這也表明所獲上述基因應(yīng)當(dāng)是FEH。我們注意到:擴(kuò)增中間片段時(shí)，利用的是已知保守氨基酸序列NWMNDPNGPM和WECPDF，與最終獲得的序列中相應(yīng)序列不能完全對(duì)應(yīng)，但這既可能是因?yàn)榇笏庵腥齻€(gè)功能區(qū)的氨基酸序列與已知的FEH保守序列不完全一致，也可能是因?yàn)槔冒被嵝蛄性O(shè)計(jì)引物時(shí)有兼并堿基、或基因測(cè)序時(shí)有個(gè)別堿基的突變。其具體原因有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)獲得的氨基酸序列與小麥、黑麥的FEH同源性為53%。根據(jù)高等植物中果聚糖的研究［2］，菊粉型果聚糖(1－FEH)主要存在于雙子葉植物中，如菊芋、菊苣，而梯牧草型果聚糖(6－FEH)常見于單子葉植物中，如禾本科的小麥。一般同屬一科的植物，F(xiàn)EH同源性較高，如同屬菊科的牛蒡，與菊苣的同源性為82%，與斑鳩菊的同源性為80%，但與菊苣中的另一FEH同源性僅為53%［14］。屬不同科的植物，一般FEH同源性較低，如藜科的甜菜與菊科的菊苣的同源性只要55%。所以只能對(duì)不同物種間的FEH同源性高低做相對(duì)的比較。大蒜屬于百合科，單子葉植物，與禾本科同源性相對(duì)較近，但仍屬于不同的科。本實(shí)驗(yàn)獲得的氨基酸序列與小麥、黑麥的FEH同源性(53%)高于屬雙子葉的菊科植物及甜菜。

3.4 本實(shí)驗(yàn)獲得酶的序列與屬百合科的石刁柏中的轉(zhuǎn)化酶(invertase，蔗糖酶)有較高同源性，且高于其與FEH的同源性。根據(jù)已有研究，F(xiàn)EH不能降解蔗糖分子，需要通過細(xì)胞壁上的轉(zhuǎn)化酶(invertase)徹底水解，F(xiàn)EH可能是從轉(zhuǎn)化酶進(jìn)化而來(lái)。分析已收錄的FEH的氨基酸個(gè)數(shù)約為560～580。而石刁柏中的轉(zhuǎn)化酶的氨基酸個(gè)數(shù)為750、739?？梢耘懦緦?shí)驗(yàn)所獲的555個(gè)氨基酸序列不是轉(zhuǎn)化酶。

3.5 基于以上已有大蒜1－FEH的研究結(jié)果、保守氨基酸序列、同源性等分析與討論，可以初步推斷本實(shí)驗(yàn)得到的是大蒜中的FEH。但仍需要進(jìn)一步通過異源表達(dá)、測(cè)定酶活性、反應(yīng)物分析等進(jìn)行驗(yàn)證。

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