肉雞飼糧中添加一水肌酸對骨骼肌肌酸吸收和代謝的影響

夏偉光 左建軍 馮定遠

(華南農業(yè)大學動物科學學院，廣州 510642)

能量代謝是維持動物體生化和生理功能的重要代謝途徑，而動物體的生化代謝與動物的生產性能密切相關，因此，通過營養(yǎng)手段調控動物的能量代謝來提高動物生產性能，尤其是肉品質，是目前動物營養(yǎng)研究的熱點之一。肌酸通?？稍趧游锏母闻K或胰腺中由精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸合成，機體中大約95%的肌酸儲存在骨骼肌中。肌酸在肌酸激酶的催化作用下可轉換成磷酸肌酸，而磷酸肌酸可為肌肉收縮提供直接能量來源——三磷酸腺苷(ATP)。有研究表明，在機體中肌酸以每天1.7%的分解速率進行分解［1］，在現代大規(guī)模集約化養(yǎng)殖條件下，快速生長的肉雞內源合成的肌酸并不能滿足自身生長的需求［2］，因此，在肉雞飼糧中補飼肌酸對肉雞的生長發(fā)育，尤其是骨骼肌的生長發(fā)育具有重要的潛在價值。細胞內的肌酸和經肌酸激酶磷酸化的產物磷酸肌酸共同參與ATP代謝，成為機體重要的穩(wěn)定供能來源［3］。骨骼肌細胞內超過90%的肌酸是通過特異的Na+/Cl－依賴性肌酸轉運載體(creatine transporter，CrT)逆濃度梯度主動吸收轉運進來的，其余則由在肌酸生理濃度(20～60 mmol/L)下發(fā)生的被動吸收過程完成［4－5］。雞的CrT mRNA序列(Gen-Bank No.JN628439.2)已經由本課題組成功克隆獲得。通過補飼肌酸來改善骨骼肌的生長發(fā)育主要體現在其提高了磷酸肌酸在肌肉中的含量。在人的研究中表明，外源添加肌酸可增加骨骼肌磷酸肌酸或總肌酸的含量［6－7］。在大鼠的試驗中還發(fā)現，白腓腸肌肌酸含量比紅腓腸肌和比目魚肌的高［8］，但是紅腓腸肌和比目魚肌對肌酸的吸收速率和CrT的蛋白合成量均顯著高于白腓腸?。?］，而添加肌酸只顯著提高了比目魚肌肌酸的含量［10］，這提示動物對肌酸的吸收和代謝可能與骨骼肌肌纖維類型有關。到目前為止，添加肌酸對骨骼肌生長發(fā)育的研究大多集中在人和大鼠方面，在畜禽特別是肉雞方面鮮有報道。雖然骨骼肌具有較大的肌酸儲備能力，但是攝入過多的肌酸可發(fā)生向肌酐的非酶轉化過程，隨后大部分肌酐通過腎臟代謝排出體外，造成添加成本的浪費。因此，本試驗旨在通過研究在肉雞基礎飼糧中添加不同水平的一水肌酸(creatine monhydrate，CMH)對骨骼肌肌酸主動吸收和生化代謝的影響，以期揭示肌酸改善肉雞骨骼肌生長發(fā)育的重要性，并為肌酸在肉雞生產中的合理應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用42日齡的健康雄性嶺南黃羽肉雞900只，隨機分成體重［(0.73 ±0.01)kg］接近的 4 個組，每個組5個重復，每個重復45只雞。對照組飼喂未添加CMH的基礎飼糧，參照我國雞飼養(yǎng)標準(2004)營養(yǎng)需要配制為粉狀配合飼料，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗組飼喂在基礎飼糧中分別添加250、500、1 000 mg/kg CMH的試驗飼糧。試驗期21d。試驗肉雞為地面平養(yǎng)，自由采食與飲水，采用24 h光照制，按正常免疫程序進行免疫。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basaldiet(air-dry basis) %

1.2 試驗材料

試驗用CMH由廣州百遨盛生物科技有限公司提供，分子式:C4H9N3O2·H2O，分子質量為149.15 ku，純度為 99%。

1.3 檢測指標

1.3.1 血清和骨骼肌生化指標測定

試驗結束(63日齡)時從每個重復中選取4只接近平均體重的試驗雞，空腹翅靜脈采血5 mL，待血液凝固后，在25℃，3 000 r/min條件下離心15 min并將血清分裝待測。放血后迅速分離出胸肌和腿肌，并快速置于液氮中，后轉入－80℃冰箱保存。

血清肌酸含量參照崔寶印等［11］的方法，利用肌酸與α－萘酚和雙乙酰在堿性條件下顯色原理直接測定。血清肌酐含量和骨骼肌中肌酸激酶的活性按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說明書方法測定。骨骼肌肌酐和肌酸含量參考Yatzidis［12］和 Taussky［13］的方法，采用苦味酸法測定。骨骼肌磷酸腺苷含量參照Zhang等［14］的方法，利用高效液相色譜儀Waters 7500(Waters，美國)進行測定，色譜條件:固定相為Purospher STAR RP-18e色譜分析柱(Merck，德國;250 mm ×4.6 mm id，5 μm)，柱溫30℃;流動相為甲醇－50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(體積比為10∶90)，用1 mol/L的 KOH溶液調 pH 至 6.5，并用 0.45 μm 微孔濾膜抽濾，流速0.8 mL/min;紫外檢測波長254 nm;進樣體積20 μL。

1.3.2 骨骼肌中CrT mRNA表達量的測定

采用Trizol(Invitrogen，美國)一步抽提法提取骨骼肌樣品(－80℃冰箱保存)的總RNA。電泳檢測:用微量加樣槍吸取 2 μL總 RNA樣在120 V，1.0%瓊脂糖膠上，電泳20 min。純度檢測:用核酸定量儀(Eppendorf，德國)檢測總RNA樣品 OD值，計算 A260nm/A280nm。經 DNaseⅠ(TaKaRa，日本)消化提純后，RNA被M-MLV反轉錄酶(Promega，美國)反轉錄成cDNA，且cDNA樣品置－20℃保存。

采用實時熒光定量PCR的方法，利用MXPro 3500基因定量儀(Stratagene，美國)檢測CrT、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT1)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和β－肌動蛋白(β-actin)的mRNA表達量，反應染料為SYBR@GreenⅠ(TaKaRa，日本)，反 應 體 系 為 20 μL:10 μL SYBR Green Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)，0.5 μL 上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL cDNA 模板，超純水補至20 μL。引物由軟件 Primer Premier 6.0設計并發(fā)送到上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列及參數見表2。反應程序為:95℃預變性1 min，95℃變性15 s，在基因特異性退火溫度條件下退火15 s，72℃延伸40 s，40個循環(huán)。參考Erkens等［15］的方法用 genNorm win 3.5 軟件從HPRT1、GAPDH和β-actin篩選出骨骼肌中表達較為穩(wěn)定的內參基因。CrT mRNA相對表達量參照Livak等［16］的方法，計算 2－ΔCt(ΔCt= 目的基因Ct－內參基因Ct)。每個樣品測定3次。

表2 實時熒光定量PCR引物序列及參數Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time fluorescence quantitative PCR

1.4 數據統計分析

試驗數據用平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比較，分別比較添加不同水平的CMH對血清和骨骼肌肌酸、肌酐含量及骨骼肌磷酸腺苷含量、肌酸激酶活性和CrT mRNA表達量的影響。P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 添加CMH對骨骼肌CrT mRNA表達量的影響

由表3可知，腿肌和胸肌CrT mRNA表達量均隨著CMH添加水平的增加而提高，其中胸肌尤為明顯。與對照組相比，添加500和1 000 mg/kg CMH顯著上調了胸肌CrT mRNA表達量(P＜0.05)，而添加250 mg/kg CMH并未達到顯著水平(P＞0.05);各CMH組之間差異不顯著(P＞0.05)。與對照組相比，添加不同水平的CMH對腿肌CrT mRNA表達量沒有顯著影響(P＞0.05)。綜上結果，表明添加不同水平的CMH可不同程度地誘導骨骼肌CrT mRNA表達量，促進骨骼肌對肌酸的吸收。

2.2 添加CMH對血清和骨骼肌肌酸生化代謝產物的影響

由表4可知，與對照組相比，添加不同水平的CMH提高了血清肌酐的含量，但沒有達到顯著水平(P＞0.05)。添加250 mg/kg CMH顯著降低了血清中肌酸的含量(P＜0.05)，添加 500和1 000 mg/kg CMH則顯著提高了血清中肌酸的含量(P＜0.05)。同時500和1 000 mg/kg CMH組的血清肌酸含量比250 mg/kg CMH組分別極顯著提高了 18.0% 和 19.3%(P ＜0.01)。而各CMH組血清肌酐/肌酸與對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，各CMH組之間也沒有表現出顯著性差異(P＞0.05)。這提示，添加250 mg/kg CMH可促進機體對肌酸的吸收利用，添加500和1 000 mg/kg則相反。

表3 添加不同水平的CMH對骨骼肌CrT mRNA表達量的影響Table 3 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on CrT mRNA expression of skeletal muscle

從胸肌來看，與對照組相比，添加250、500、1 000 mg/kg CMH均極顯著提高胸肌肌酸含量(P＜0.01)，不同CMH組之間差異不顯著(P＞0.05);且隨著CMH添加水平的增加，胸肌肌酐的含量呈現劑量依賴性上升。添加 250、500、1 000 mg/kg CMH均顯著降低了胸肌的肌酐/肌酸(P ＜0.05)。

從腿肌來看，與對照組相比，肌酐含量表現出與胸肌一樣的規(guī)律，即隨著CMH添加水平的增加而提高。不同的是添加CMH對腿肌的肌酸含量并沒有顯著影響(P＞0.05)，從而導致腿肌的肌酐/肌酸隨著肌酸添加水平的增加而提高，并且500和1 000mg/kgCMH組較對照組和250 mg/kg CMH組有顯著的提高(P＜0.05)。

在某種程度上，這表明肌酸在腿肌中代謝效率高于胸肌，而添加250 mg/kg CMH則更有利于腿肌肌酸的儲備。

2.3 添加CMH對骨骼肌肌酸激酶活性的影響

由表5可知，與對照組相比，添加不同水平的CMH對腿肌肌酸激酶活性沒有顯著影響(P＞0.05);但可顯著提高胸肌肌酸激酶活性(P＜0.05)，提高幅度分別為 18.6%、10.0%、17.1%，各CMH組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表4 添加不同水平的CMH對肌酸生化代謝產物的影響Table 4 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on creatine biochemical metabolites

腿肌肌酸激酶活性稍高于胸肌。肌酸激酶是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷?；磻?。以上結果提示，添加不同水平的CMH均可間接提高胸肌磷酸肌酸的含量，從而為肉雞的生理生化代謝提供足夠的能量儲備，并以添加250 mg/kg CMH效果更為明顯。

表5 添加不同水平的CMH對骨骼肌肌酸激酶活性的影響Table 5 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on creatine kinase activity of skeletal muscle U/mg prot

2.4 添加CMH對骨骼肌磷酸腺苷含量的影響

由表6可知，與對照組相比，添加不同水平的CMH 對胸肌 ATP、ADP、AMP、TAN 含量和 EC、ATP/ADP均沒有顯著影響(P＞0.05)，但顯著或極顯著降低了AMP/ATP(P＜0.05或P＜0.01);500 mg/kg CMH組的AMP/ATP顯著低于1 000 mg/kg CMH 組(P ＜0.05)，但與250 mg/kg CMH組相比差異不顯著(P＞0.05)。

腿肌方面，與對照組相比，添加不同水平的CMH對其ADP含量和EC、ATP/ADP、AMP/ATP的影響未達顯著水平(P＞0.05)，各CMH組之間差異不顯著(P＞0.05);添加250和1 000 mg/kg CMH顯著提高腿肌ATP含量(P＜0.05)，其提高幅度分別為48.4%和39.2%，但添加500 mg/kg CMH與對照組相比并沒有顯著影響(P＞0.05);添加不同水平的CMH對腿肌AMP含量有所提高，其中添加250 mg/kg達到顯著水平(P＜0.05);同時，綜合腿肌 ATP、ADP、AMP 含量的結果，發(fā)現添加 CMH均提高了其 TAN含量，且250 mg/kg CMH組比對照組顯著提高了30.4%(P＜0.05)，同時高于其他 CMH組，但添加500和1 000 mg/kg CMH與對照組相比差異不顯著(P ＞0.05)。

這表明，添加CMH可使胸肌的ATP合成反應加快，有利于能量的儲存;同時提高腿肌TAN含量并表現出隨著CMH添加水平的增加而減少的趨勢。

表6 添加不同水平的CMH對骨骼肌磷酸腺苷含量的影響Table 6 Effects ofdifferent CMH supplemental levels on adenosine phosphate content of skeletal muscle μmol/mL

3 討論

3.1 添加CMH對骨骼肌肌酸吸收的影響

機體對肌酸的吸收主要通過Na+/Cl－依賴性CrT的主動轉運進行，在機體中存在2種不同亞型的肌酸轉運載體CrT1和CrT2。在哺乳動物中，CrT1主要分布在能量代謝比較旺盛的組織，如心、肺、腦、肌肉、腎、脾、小腸等［17－19］;在非哺乳動物如禽類CrT1組織特異性也表現出類似的結果，并發(fā)現其在骨骼肌的 mRNA表達量最高［20］。而CrT2主要分布在睪丸并表現較為活躍［21］。骨骼肌細胞中的肌酸已被證實是通過骨骼肌中的CrT1吸收的［9，22］，通常骨骼肌中的 CrT1 也被稱為 CrT。

骨骼肌對肌酸吸收的影響因素有很多，可能涉及到CrT的轉錄、翻譯或后翻譯水平的改變。但從總體上來說主要有2方面:一是通過影響CrT的磷酸化和糖基化從而影響其活性;二是通過調控CrT的表達來影響轉運肌酸進入細胞內的含量。CrT分子結構中所含有的2～3個碳原子間隔開的一個羧基和一個胍基決定了其對轉運底物的高度特異性［23］，不能轉運肌酐、磷酸肌酸以及肌酸類似物谷氨酸、甘氨酸、3－羥基丁酸、5－羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素、γ－氨基丁酸、膽堿、牛磺酸、β － 丙氨酸等［24－25］。由于肌酸是 CrT 的特異性底物，細胞內肌酸或總肌酸含量可能影響到CrT的表達調控。Murphy等［8］的研究發(fā)現，大鼠總肌酸含量較低的比目魚肌和紅腓腸肌，其CrT蛋白含量高于總肌酸含量較高的白腓腸肌。長期補飼肌酸使大鼠后肢肌肉股四頭肌的CrT蛋白表達量降低［26］。本研究發(fā)現，添加CMH對肉雞胸肌CrT mRNA表達量的上調達到顯著水平。由于肉雞胸肌主要由酵解型的肌纖維組成［27］，因此在某種程度上可以看出添加肌酸可顯著提高酵解型肌纖維組成的骨骼肌CrT mRNA表達量，以促進其對肌酸的吸收。這與前人在哺乳動物上的研究結果有一定的差異。除了存在動物種類差異的因素以外，也可能是添加肌酸對骨骼肌CrT蛋白合成的影響與mRNA有所不同。同時本研究還發(fā)現，添加CMH對腿肌CrT mRNA表達量沒有顯著影響，這一結果可能是由于腿肌中含有大量的肌酸，而補飼CMH對其肌酸吸收的刺激作用并不明顯。所以有研究學者認為，細胞內的肌酸濃度起到了調節(jié)骨骼肌對肌酸吸收以及CrT活性和含量的作用，而這種調節(jié)作用有可能是通過激活AMP依賴性蛋白激酶(AMPK)的細胞信號通路來實現的［28］。具體的機理還有待進一步的研究。

3.2 添加CMH對骨骼肌肌酸代謝的影響

肌酸被CrT主動轉運吸收進入骨骼肌細胞后，線粒體內的肌酸激酶可將其磷酸化為磷酸肌酸，當機體尤其是代謝較旺盛的骨骼肌急需要能量供應的時候，磷酸肌酸在胞漿肌酸激酶的催化作用下降解為肌酸，同時釋放出可供直接利用的ATP。因此，在具有能量緩沖作用的肌酸代謝這一過程中，肌酸激酶發(fā)揮著重要的作用。有研究學者將細胞內的肌酸、磷酸肌酸以及肌酸激酶稱為磷酸肌酸能量穿梭系統［29］。肌酸激酶除了參與肌酸的能量代謝過程，Meyer等［30］的研究還發(fā)現，線粒體的肌酸激酶通過ADP再利用循環(huán)機制降低了線粒體氧自由基的產生從而起到抗氧化的作用。這提示，在動物受到應激或肌肉損傷的情況下，提高肌肉的肌酸激酶活性可以作為改善肌肉生長發(fā)育的有效措施之一。Daroit等［31］研究提出，在宰后肌肉向肉轉變的過程中，肌酸激酶發(fā)揮著重要的作用，因此，可以把肌肉的肌酸激酶活性作為肉品質評定的指標之一。這在一定程度上證明骨骼肌的能量代謝和肉品質具有密切的聯系。本試驗結果表明，添加CMH使宰后胸肌肌酸激酶活性顯著提高，胸肌肌酸含量也相應地提高，顯著降低了肌酐/肌酸。這可能是添加CMH增加了胸肌肌酸含量的同時也提高了高能磷酸化合物磷酸肌酸的儲備。而研究表明肌肉中大量的磷酸肌酸儲備對宰后延緩其糖酵解發(fā)生和pH下降具有重要的作用［32－33］。有趣的是，本研究還發(fā)現，添加 CMH 對腿肌的肌酸代謝與胸肌的情況并不一致，添加低水平(250 mg/kg)CMH對其肌酸的代謝沒有顯著的影響，而隨著CMH添加水平的提高，腿肌肌酐含量和肌酐/肌酸比對照組顯著提高，同時肌酸激酶的活性也表現出下降的趨勢，由此可見，添加500和1 000 mg/kg CMH使腿肌的肌酸向肌酐轉化的代謝能力增強。

磷酸腺苷(ATP、ADP和AMP)是所有生物組織內生物能量轉換的高能磷酸化合物，是維持動物生命活動直接的能量來源，細胞內的能量狀態(tài)取決于ATP、ADP和AMP的相對含量;EC是細胞中高能磷酸鍵狀態(tài)的一種數量上的衡量。研究表明，骨骼肌中 ATP含量下降，ADP過量累積和AMP含量升高都會降低骨骼肌細胞的收縮速度［34－35］，因此，ATP/ADP 和 AMP/ATP 都可以用來反映肌肉是否處于疲勞或能量耗竭狀態(tài)。為了進一步研究添加CMH對骨骼肌能量代謝的影響，本試驗還檢測了添加不同水平的CMH處理后肉雞骨骼肌磷酸腺苷的含量。研究結果發(fā)現，添加不同水平的CMH顯著降低了胸肌AMP/ATP，這表明此時骨骼肌細胞處于能量充盈的狀態(tài);添加CMH可促進胸肌的ATP合成，生成較多的ATP除了可以直接提供能量以外，還有利于ATP的儲存。這與添加CMH提高肌酸含量和肌酸激酶活性以間接提高磷酸肌酸的儲備結果相一致。而添加低水平(250 mg/kg)CMH可顯著提高腿肌ATP、AMP和TAN含量，但添加不同水平的CMH對其EC、ATP/ADP和AMP/ATP的影響均沒有顯著差異，這說明添加CMH對腿肌的能量代謝沒有顯著影響。究其原因，一方面可能是不同部位的骨骼肌其肌纖維類型組成存在一定的差異，前人的研究結果提示肌酸含量高的肌纖維對外源肌酸的吸收轉運能力弱于肌酸含量低的肌纖維，導致添加肌酸對其能量代謝的影響效果并不理想;另一方面，從其機理來看，AMPK的活性與細胞能量代謝的幾種蛋白表達調控相關［36］，細胞內磷酸肌酸/肌酸下降或 AMP/ATP上升都可能激活AMPK來調節(jié)細胞的能量代謝，使細胞能量維持穩(wěn)態(tài)［37－38］。Sestili等［39］在體外細胞培養(yǎng)的研究中發(fā)現，添加肌酸使C2C12細胞中的肌酸含量增加，磷酸肌酸含量無變化，磷酸肌酸/肌酸下降。由此推測，在飼糧中添加CMH對肉雞骨骼肌能量代謝的影響可能與AMPK的激活有關。但是添加CMH是否對骨骼肌AMPK的活性具有調控作用還需要進一步的深入研究。在骨骼肌細胞添加肌酸培養(yǎng)過程中同時添加AMPK的阻斷劑或激動劑處理可有助于探討CMH對骨骼肌AMPK活性的調控。

4 結論

①本試驗條件下，在肉雞基礎飼糧中連續(xù)補飼21d 不同水平(250、500、1 000 mg/kg)的 CMH可不同程度地促進骨骼肌對肌酸的吸收。

②添加低水平(250 mg/kg)的CMH更有利于增加胸肌肌酸和磷酸肌酸的儲備，較好地增強肌酸代謝池的能量緩沖作用。

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