低氧下HIF-1α對小鼠性激素及睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響*

陳香梅,熊艷蕾,龔 輝,徐成麗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院,北京 100005)

隨著越來越多的平原人進(jìn)入高海拔地區(qū)旅游或工作,低氧對男性生殖系統(tǒng)的影響應(yīng)得到重視。國外報(bào)道:進(jìn)入5 200m高海拔低氧環(huán)境的9名男性登山員,經(jīng)過7周的低氧暴露后其血漿睪酮水平顯著下降[1]。6名男性暴露于2 000～5 600 m高海拔低氧環(huán)境26 d后,返回海平面地區(qū)時及1個月后其精子計(jì)數(shù)顯著下降,精子畸形率顯著升高;精子活率在返回海平面地區(qū)時未有顯著變化,但1個月后精子活率顯著下降[2]。這些由低氧引起的睪酮水平降低和精子各項(xiàng)指標(biāo)異常均可導(dǎo)致男性不育。

HIF-1α在低氧條件下產(chǎn)生并作為蛋白調(diào)節(jié)因子與多種靶基因結(jié)合調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性,介導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生一系列的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)[3]。哺乳動物睪丸內(nèi)精子的發(fā)生,存在自發(fā)的生精細(xì)胞凋亡,除正常精子發(fā)生過程中的生精細(xì)胞凋亡,在各種因素(激素回撤、熱刺激、電離輻射、接觸有毒物質(zhì)等)刺激下也會誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡增多,精子發(fā)生障礙。生精細(xì)胞凋亡在控制生精細(xì)胞數(shù)量上有重要作用。本文旨在探討模擬海拔5 000 m低氧環(huán)境下,C57BL/6雄性小鼠睪丸HIF-1α對生精細(xì)胞凋亡和下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素血清睪酮(testosterone,T)、游離睪酮(free testosterone,FT)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)水平的調(diào)控作用。為了深入研究低氧環(huán)境引起男性機(jī)體睪酮水平下降和精子發(fā)育異常的機(jī)制,進(jìn)行了本次實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 建立低氧動物模型

80只SPF級18～22 g雄性C57BL/6小鼠(購自維通利華公司)隨機(jī)分為低氧3、7、14和28 d組及對應(yīng)的常氧組,每組10只。低氧各組小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室內(nèi)的低壓低氧艙(FLYDWC50-IC)中,升降速度為4～5 m/s達(dá)到模擬海拔5 000 m高度,每天除按時開艙打掃衛(wèi)生、更換食物和水約40 min外連續(xù)低氧,光照12 h,自由進(jìn)食進(jìn)水。常氧組飼養(yǎng)于SPF級動物室內(nèi)。

1.2 標(biāo)本采集

分別于建模3、7、14和28 d后稱重,取眼球血約1 ml,頸椎脫臼處死小鼠。血樣品靜止2 h,3 500 r/min離心15 min,收集上層血清,待測血清T、FT、FSH和LH激素濃度。取小鼠雙側(cè)睪丸稱重,計(jì)算睪丸指數(shù)(睪丸指數(shù)=雙側(cè)睪丸重量/體重×100%);左側(cè)睪丸液氮保存;右側(cè)睪丸置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,制備連續(xù)切片。取小鼠右側(cè)附睪,制備精子懸液。

1.3 ELISA法檢測血清T,FT,FSH,LH濃度

用美國R&D公司小鼠睪酮(T)、游離睪酮(FT)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作檢測激素濃度。

1.4 附睪精子懸液精子計(jì)數(shù)、精子活率及精子畸形率的檢測

小鼠右側(cè)附睪,置于1 ml 37℃生理鹽水中,充分剪碎混勻,用200目濾網(wǎng)過濾,收集精子濾液。取精子濾液少許滴于載玻片上,高倍鏡下隨機(jī)鏡檢300個精子,精子活率=(運(yùn)動精子數(shù)/300)×100%;取精子濾液推片做HE染色,高倍鏡下隨機(jī)鏡檢1 000個完整的精子,記錄畸形精子數(shù),精子畸形率=(畸形精子總數(shù)/1 000)×100%;取50 μ l精子濾液稀釋16倍后,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)懸液中的精子數(shù)。

1.5 TUNEL法檢測睪丸生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)(apoptosis index)

用德國Roche Applied Science公司TUNEL凋亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD),嚴(yán)格按照說明書操作。細(xì)胞核有明顯棕黃色著色即為陽性細(xì)胞,每組隨機(jī)計(jì)數(shù)100個生精小管中陽性細(xì)胞個數(shù)和總細(xì)胞數(shù),并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI:每1 000個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個數(shù))。

1.6 Western blot檢測睪丸HIF-1α的表達(dá)

β-actin(Subrray 公司 ,Sr25113)濃度 1∶1 000,HIF-1α(美國 Abcam,ab113642)濃度 1∶500,一抗均 4℃孵育過夜;HRP標(biāo)記羊抗小鼠多克隆抗體(AbMax公司)濃度1∶4 000,室溫孵育2 h。按增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)的使用說明配制發(fā)光底物工作液,顯影定影。用Image J軟件對各蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描,以內(nèi)參蛋白β-actin為基準(zhǔn),計(jì)算HIF-1α的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 低氧對 C57BL/6小鼠血清T、FT、FSH、LH水平的影響

與對應(yīng)的常氧組相比:低氧3 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平顯著升高(P＜0.05);低氧7 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平無顯著變化;低氧14 d組小鼠血清T、LH水平顯著下降(P＜0.05),FT和FSH水平較常氧14 d組無明顯下降;低氧28 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平均較常氧28 d組無明顯下降。與低氧3 d組相比,低氧7、14和28 d組小鼠血清T、FT、FSH和LH水平顯著降低(P＜0.05)。與低氧7 d組相比,低氧14 d組小鼠血清T顯著降低(P＜0.05)以及低氧28 d組小鼠血清LH顯著降低(P＜0.01)。與低氧14 d組相比,低氧28 d組小鼠血清FT和LH顯著升高(P＜0.05,表1)。

2.2 低氧對C57BL/6小鼠附睪精子計(jì)數(shù)、精子活率和精子畸形率的影響

與對應(yīng)的常氧組相比:低氧3 d組附睪精子計(jì)數(shù)及精子活率無明顯變化,低氧7和14 d組顯著下降(P＜0.05),低氧28 d組較常氧28 d組無明顯下降;低氧各組附睪精子畸形率均顯著升高(P＜0.01)。與低氧3 d組相比,低氧7和 14 d小鼠附睪精子計(jì)數(shù)和精子活率均顯著降低(P＜0.01,表2)。低氧各組間小鼠附睪精子畸形率無顯著變化。

2.3 低氧對C57BL/6小鼠睪丸形態(tài)的影響

取材時見低氧各組睪丸外觀呈紅色充血狀(圖1見彩圖頁Ⅴ)。與對應(yīng)的常氧組相比:低氧各組小鼠體重顯著減少(P＜0.05);低氧14和28 d組雙側(cè)睪丸重量顯著下降(P＜0.05);低氧3 d和7 d組睪丸指數(shù)顯著升高(P＜0.05),低氧14和28 d組睪丸指數(shù)較對應(yīng)的常氧組無明顯升高。與低氧3 d組相比,低氧各組小鼠體重顯著增加(P＜0.05);低氧14和28 d組睪丸指數(shù)顯著降低(P＜0.05)。與低氧14 d組相比,低氧28 d組小鼠體重顯著增加(P＜0.05,表3)。HE染色顯示光鏡下低氧各組間質(zhì)血管擴(kuò)張充血,部分區(qū)域有均勻紅染的滲出液,間質(zhì)水腫。低氧14 d組和28 d組生精小管出現(xiàn)生精上皮結(jié)構(gòu)紊亂,管腔內(nèi)精原細(xì)胞和精母細(xì)胞數(shù)量有不同程度的減少。低氧28 d組部分區(qū)域可見生精小管萎縮,生精細(xì)胞缺失(圖2見彩圖頁Ⅴ)。

Tab.1 Comparison of C57BL/6 mice serum T,FT,FSH and LH level between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

Tab.1 Comparison of C57BL/6 mice serum T,FT,FSH and LH level between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

T:Testosterone;FT:Free testosterone;FSH:Follicle-stimulating hormone;LH:Luteinizing hormone;N:Normoxia group;H:Hypoxia group*P＜0.05,**P＜0.01 vs normoxia group;#P＜0.05,##P ＜0.01 vs hypoxia group of 3 d;ΔP＜0.05,Δ ΔP＜0.01 vs hypoxia group of 7 d;▲P＜0.05 vs hypoxia group of 14 d

Group T(nmol/l) FT(nmol/l) FSH(U/L) LH(pg/l)3 d N 34.40±7.93 2.73±0.73 2.93±0.72 318.9±82.1 H 51.19±10.32** 3.83±0.79* 4.01±0.88* 471.4±47.0**7 d N 32.15±11.18 2.62±1.10 2.89±0.74 289.3±44.0 H 31.78±8.49## 2.29±0.56## 3.00±0.68# 294.7±65.0##14 d N 32.48±9.58 2.27±0.72 3.13±0.65 284.3±65.0 H 25.14±3.25*##Δ 2.01±0.27## 2.82±0.51## 225.4±15.2*##Δ Δ 28 d N 31.85±10.14 2.60±0.93 3.21±0.76 317.0±63.0 H 28.61±5.04## 2.34±0.36##▲ 2.91±0.66## 279.7±76.2##▲

Tab.2 Comparison of C57/BL6 mice sperm count,motility rate and abnormal sperm rate between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

Tab.2 Comparison of C57/BL6 mice sperm count,motility rate and abnormal sperm rate between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

N:Normoxia group;H:Hypoxia group*P＜0.05,**P＜0.01 vs normoxia group;##P＜0.01 vs hypoxia group of 3 d

Sperm motility rate(%)Abnormal sperm rate(%)Group Sperm count(×106)3 d N 8.73±0.69 15.86±2.71 0.48±0.15 H 8.54±1.39 17.07±3.48 1.07±0.21**7 d N 7.93±2.15 16.00±4.18 0.50±0.25 H 5.60±1.33*##11.53±4.14*##1.24±0.36**14 d N 8.74±1.98 17.08±4.68 0.42±0.16 H 5.53±0.87**##11.11±2.26*##1.28±0.38**28 d N 9.12±1.48 18.38±4.88 0.46±0.13 H 7.00±1.81 14.07±5.52 1.33±0.33**

Tab.3 Comparison of C57BL/6 mice body weight and both side testis between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

Tab.3 Comparison of C57BL/6 mice body weight and both side testis between hypoxia groups and normoxia groups(±s,n=10)

N:Normoxia group;H:Hypoxia group*P＜0.05,**P＜0.01 vs normoxia group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs hypoxia group of 3 d;△P＜0.05 vs hypoxia group of 14 d

Group Body weight(g)Testisweight(g)Testisweight/body weight(%)3 d N 22.49±1.07 0.156±0.008 0.69±0.05 H 17.63±1.01** 0.148±0.019 0.84±0.08**7 d N 22.78±2.17 0.150±0.130 0.66±0.10 H 19.98±3.11*# 0.149±0.016 0.76±0.10*14 dN 23.77±0.80 0.164±0.016 0.69±0.08 H 19.46±1.33**##0.147±0.013*0.75±0.04#28 dN 24.58±1.35 0.180±0.009 0.73±0.03 H 21.51±1.98**##△0.160±0.015*0.75±0.08#

2.4 低氧對C57BL/6小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響

常氧組中僅有少量凋亡細(xì)胞位于生精小管基底膜附近,以精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞為主。與常氧組相比,低氧3 d組凋亡指數(shù)無顯著變化;低氧7、14和28 d組凋亡指數(shù)顯著升高(48.83±13.79vs84.50±12.50,114.00±19.05,71.67±12.13,P＜0.05),凋亡細(xì)胞主要是精母細(xì)胞,也有少量圓形精子細(xì)胞凋亡。與低氧3 d組相比,低氧7、14和28 d組凋亡指數(shù)顯著升高(52.83±13.29vs84.50±12.50,114.00±19.05,71.67±12.13,P＜0.05)。與低氧7 d組相比,低氧14 d組凋亡指數(shù)顯著升高(84.50±12.50vs114.00±19.05,P＜0.05)。與低氧14 d組相比,低氧28 d組凋亡指數(shù)顯著降低(114.00±19.05vs71.67±12.13,P＜0.01,圖 3,4圖3見彩圖頁Ⅴ)。

2.5 低氧對C57BL/6小鼠睪丸HIF-1α表達(dá)的影響

與常氧組相比,低氧3 d組小鼠睪丸HIF-1α的蛋白表達(dá)水平無明顯增加;低氧7、14和28 d組HIF-1α的蛋白表達(dá)水平明顯升高(1.17±0.26vs1.38±0.20,1.65±0.27,1.71±0.29,P＜0.05)。與低氧3 d組相比,低氧14和28 d組小鼠睪丸HIF-1α的蛋白表達(dá)水平顯著升高(1.23±0.16vs1.65±0.27,1.71±0.29,P＜0.05,圖5)。

Fig.4 Apoptosis index of C57BL/6 mice testis after induction of hypoxia(±s,n=10)

Fig.5 HIF-1αprotein expression level of C57BL/6mice testis after induction of hypoxia

2.6 性激素水平、精子各項(xiàng)參數(shù)、凋亡指數(shù)AI及HIF-1α表達(dá)之間的相關(guān)性分析

低氧3 d組HIF-1α的表達(dá)與T呈負(fù)相關(guān)(r=-0.999,P=0.035),其余指標(biāo)之間無顯著相關(guān);低氧7 d組各指標(biāo)之間無顯著相關(guān);低氧14 d組精子畸形率與AI呈正相關(guān)(r=0.933,P=0.007),其余指標(biāo)之間無顯著相關(guān);低氧28 d組HIF-1α的表達(dá)與AI呈正相關(guān)(r=0.791,P=0.042),FT與精子活率呈正相關(guān)(r=0.680,P=0.044),其余指標(biāo)之間無顯著相關(guān)。

3 討論

本研究采用低壓氧艙模擬海拔5 000 m高原低氧環(huán)境,動態(tài)研究低氧對C57BL/6小鼠血清下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素水平的影響。機(jī)體在高海拔急性低氧時睪酮增加,促進(jìn)紅細(xì)胞生成,血紅蛋白增多提高氧的運(yùn)輸能力,與機(jī)體在高海拔地區(qū)習(xí)服與適應(yīng)的過程緊密聯(lián)系[4]。低氧3 d時,下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素T、FT、FSH和LH釋放增多,即急性低氧時小鼠呈應(yīng)激狀態(tài),可能與機(jī)體有效適應(yīng)急性低氧環(huán)境有關(guān)。隨低氧時間延長機(jī)體持續(xù)高水平的睪酮會導(dǎo)致紅細(xì)胞持續(xù)增多,降低動脈血氧飽和度,呼吸效率低下,降低通氣量,最終導(dǎo)致慢性高原病,所以高水平的睪酮對于高海拔低氧的適應(yīng)是不利的[4]。本研究顯示隨著低氧時間延長至14 d時小鼠下丘腦-腺垂體-睪丸軸激素水平都不同程度地降低,與機(jī)體有效適應(yīng)高海拔低氧有關(guān)。國內(nèi)也有研究表明模擬海拔5 000 m高原低氧30 d可抑制成年Wistar大鼠睪酮的分泌[5];模擬海拔3 000和5 000 m高原低氧14 d可抑制成年SD大鼠睪酮的分泌[6]。盡管如此,本研究低氧28 d組小鼠血清FT與精子活率呈正相關(guān),表明慢性低氧時機(jī)體低水平的FT可導(dǎo)致精子活率下降,進(jìn)而影響生殖功能。

低氧環(huán)境下機(jī)體低水平的性激素必然會影響睪丸的形態(tài)與功能。睪丸間質(zhì)Leydig細(xì)胞分泌T后一部分入血,作用于遠(yuǎn)方的靶組織,參與對性行為的調(diào)節(jié)和雄性第二性征的維持;睪丸組織內(nèi)的T作用于生精上皮,參與對精子發(fā)生的調(diào)節(jié)。在成年期,FSH和T協(xié)同作用于精原細(xì)胞,并維持生成精子的數(shù)量和質(zhì)量,精子的發(fā)生主要受FSH和T這兩個激素的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)低氧小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡增多,表明低氧環(huán)境下機(jī)體低水平的T和FSH可能參與了生精細(xì)胞的凋亡,影響了精子的生成。國內(nèi)也有研究表明:低氧誘導(dǎo)成年Wistar大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡增多,慢性低氧(低氧30 d)引起的睪丸生精細(xì)胞凋亡增多與凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)增加有關(guān)[7]。

國外研究表明動物睪丸的微環(huán)境是相對低氧的,依據(jù)是(1)精子發(fā)生過程所需的氧耗量高,(2)睪丸組織增加血流量的調(diào)控能力較低,(3)睪丸中的氧分壓相對較低[8,9]。低氧環(huán)境可進(jìn)一步加重小鼠睪丸缺氧,正如本研究所示低氧各組小鼠睪丸肉眼觀呈紅色充血狀,低氧各組睪丸指數(shù)不同程度增加,說明睪丸組織有不同程度的水腫;HE染色顯示間質(zhì)血管擴(kuò)張充血,部分區(qū)域有均勻紅染的滲出液,間質(zhì)水腫。

低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是由120 kD α亞單位和91-94kDβ亞單位組成的轉(zhuǎn)錄因子,作為組織缺氧的重要標(biāo)志,可以上調(diào)細(xì)胞存活、生長、分化、及凋亡等基因的表達(dá),以維持組織和細(xì)胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,以適應(yīng)缺氧。HIF-1α作為低氧應(yīng)激蛋白,在組織低氧時表達(dá)增加。相關(guān)性分析表明低氧3 d組HIF-1α的表達(dá)與T呈負(fù)相關(guān);隨著低氧時間的延長HIF-1α表達(dá)逐漸增加,并維持在高水平狀態(tài),與低氧組小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡增多一致,表明低氧組小鼠睪丸HIF-1α的高表達(dá)可能也參與了生精細(xì)胞的凋亡,低氧28 d組HIF-1α的表達(dá)與AI呈正相關(guān)。在研究精索靜脈曲張的大鼠模型中,睪丸血流瘀滯,組織發(fā)生變性,睪丸處于低氧狀態(tài),并且睪丸高表達(dá)HIF-1α,生精細(xì)胞凋亡增加,二者之間呈正相關(guān)[10]。上述均可以說明HIF-1α在睪丸組織低氧應(yīng)激情況下,可能參與了生精細(xì)胞的凋亡。因此進(jìn)一步的研究將會圍繞HIF-1α在低氧環(huán)境下影響生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制來展開。

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