番茄紅素對帕金森模型小鼠氧化應(yīng)激損傷及神經(jīng)行為的影響*

劉重斌,王 瑞,潘慧斌,丁啟峰,陸峰彬

(1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理與藥理學(xué)教研室,浙江湖州313000,2.溫州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,浙江溫州 325035)

帕金森病(Parkinson'disease,PD)在病理上表現(xiàn)為黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元變性、丟失,膠質(zhì)增生,胞漿內(nèi)出現(xiàn)特征性嗜酸性包涵體即路易體(lewy bodies,LBs),而α-突觸核蛋白 (α-synuclein,α-SYN)是LBs的主要成分[1-2]。PD 發(fā)病與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及α-SYN異常有關(guān)[3]。因此,減輕氧化應(yīng)激損傷可作為藥物作用靶點(diǎn)之一用于神經(jīng)保護(hù)藥物的篩選。一些天然的抗氧化劑如茶多酚(tea polyphenols)、姜黃素(curcumin)和白藜蘆醇(resveratrol)的研究表明對 PD具有一定的保護(hù)作用[4-5]。番茄紅素(lycopene,LP)是類胡蘿卜素的一種,有極強(qiáng)的清除自由基能力,能預(yù)防和修復(fù)動脈粥樣硬化、前列腺和胸腺癌等癌癥帶來的氧化應(yīng)激損傷[6]。本研究旨在利用魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型,探討番茄紅素對小鼠黑質(zhì)致密區(qū)和紋狀體神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能機(jī)制,為開發(fā)具有抗P D作用的天然藥物提供初步實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 魚藤酮(rotenone)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司,玉米油購自山東魯花集團(tuán)有限公司,番茄紅素購自ToxSoms公司,鼠α-SYN單克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德公司,鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)單克隆抗體、兔微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 3 light chain,LC3-B)多克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)公司,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.1.2 儀器 SpectraMax M2酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);WMT-200水迷路視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。Nikon SIM顯微鏡及NIS-Elements圖像分析系統(tǒng)(德國尼康公司)。

1.2 實(shí)驗動物分組和處理

成年雄性C57BL/6小鼠40只,體重25.4～28.2 g,由中科院上海實(shí)驗動物中心提供,動物使用許可證號:浙 22-005234。小鼠按體重隨機(jī)分為空白對照、魚藤酮、番茄紅素、番茄紅素+魚藤酮共4組(n=10)。魚藤酮先溶于極低體積的DMSO,然后溶于玉米油(配成2 mg/ml油溶液)。魚藤酮組每日于頸背部皮下注射魚藤酮油溶液(3 mg/kg小鼠體重)[7-8],空白對照組于頸背部皮下注射等體積的玉米油(含相應(yīng)體積的DMSO),番茄紅素組每日灌胃番茄紅素(10 mg/kg小鼠體重,灌胃前先溶于等體積的玉米油),番茄紅素+魚藤酮組每日于頸背部皮下注射魚藤酮,同時灌胃番茄紅素[3]。實(shí)驗期間所有小鼠自由飲食和飲水,溫度22～25℃,相對濕度60%～70%。每日觀察動物一般狀態(tài)表現(xiàn)并記錄動物行為變化,持續(xù)5周。

1.3 WMT-200水迷路

WMT-200水迷路視頻分析系統(tǒng)采用計算機(jī)視覺相關(guān)算法,實(shí)時跟蹤動物的行為狀態(tài),并分析和記錄動物入水后搜索目標(biāo)所需的時間、采取的策略和游泳的軌跡。實(shí)驗程序包括:(1)定位航行實(shí)驗:實(shí)驗前將小鼠置于站臺上適應(yīng)20 s,隨后將小鼠隨機(jī)從不同象限面壁置入池內(nèi),小鼠登上站臺5 s后終止記錄,最長記錄時間為30 s(若30 s內(nèi)不能上臺,引導(dǎo)小鼠登上站臺適應(yīng)10 s,最后將小鼠擦干放人鼠籠)。如此將小鼠置入游泳池,3次為 1組,分別測量四組小鼠平均逃逸時間,以評價其空間學(xué)習(xí)能力。在實(shí)驗處理后第2、3、4和5周重復(fù)上述步驟。(2)空間探索實(shí)驗:定位航行1 d后撤除水面下的站臺,然后將小鼠隨機(jī)從不同象限內(nèi)壁置入池內(nèi)5次。每次記錄小鼠在30 s內(nèi)的游泳軌跡,并測量小鼠在靶象限的活動時間,以評判小鼠的空間記憶能力。在實(shí)驗處理后的第2、3、4和5周重復(fù)進(jìn)行空間探索實(shí)驗。

1.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

5周行為檢測后,采用脫頸法迅速斷頭取腦,在冰面上迅速分離出中腦黑質(zhì)和紋狀體,玻璃勻漿器制成 10%組織勻漿,-80℃冰箱保存。實(shí)驗時用Braford法定量蛋白,按照試劑盒說明書,采用化學(xué)比色法檢測腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

分別切取中腦黑質(zhì)和紋狀體組織,投入4℃4%多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋,連續(xù)做冠狀切片(厚5 μ m)。切片經(jīng)消除內(nèi)源過氧化物酶活性、抗原修復(fù)、PBS沖洗后,分別加入鼠TH單克隆抗體(1∶200)、鼠α-SYN 單克隆抗體(1∶100)、兔 LC3-B多克隆抗體(1∶300)4℃孵育過夜。PBS沖洗后,采用SABC免疫組織化學(xué)試劑盒室溫孵育30 min。切片經(jīng)PBS沖洗、DAB顯色、脫水、透明、封固后于顯微鏡下觀察并攝影。每只小鼠隨機(jī)選取5張切片,每張切片隨機(jī)選取4個視野,在同一視場面積,同一放大倍數(shù),同一背景光強(qiáng)度下采集圖像。采用NIS-Elements圖像分析系統(tǒng)軟件統(tǒng)計TH、α-SYN、LC3-B免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)表現(xiàn)和體重變化

魚藤酮組小鼠從實(shí)驗開始第10天出現(xiàn)精神萎靡,活動緩慢,毛發(fā)松散而無光澤,食欲明顯減退,第16天開始相繼出現(xiàn)身體屈曲,運(yùn)動減少,時而伴有強(qiáng)直、震顫表現(xiàn),顯示帕金森的典型行為特征,表明帕金森病小鼠造模成功[3]。其余3組小鼠未出現(xiàn)身體屈曲,運(yùn)動減少,強(qiáng)直、震顫表現(xiàn)。對各組小鼠每日體重測量發(fā)現(xiàn),魚藤酮組小鼠體重增長較其它各組緩慢,但組間比較均無顯著性差異(P＞0.05,圖1)。

2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)

2.2.1 小鼠中腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo) 魚藤酮組小鼠MDA含量顯著高于空白對照和番茄紅素組(P＜0.05,表1),而魚藤酮+番茄紅素組小鼠MDA含量顯著低于魚藤酮組 (P＜0.05)。魚藤酮組小鼠GSH-Px、SOD、CAT酶活力顯著低于空白對照和番茄紅素組(P＜0.05),而魚藤酮+番茄紅素組小鼠GSH-Px、SOD、CAT酶活力顯著高于魚藤酮組(P＜0.05)。其他組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。

Fig.1 Curve graphfor body weight changes in each group ofmice(±s,n=10)

Tab.1 Effect of lycopene on lipid peroxidation and antioxidant defense in the substantia nigra of rotenone treated mice(±s,n=10)

Tab.1 Effect of lycopene on lipid peroxidation and antioxidant defense in the substantia nigra of rotenone treated mice(±s,n=10)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;GSH-Px:Glutathione peroxidase;CAT:Catalase*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs lycopene group;△P＜0.05 vs rotenone group

Group MDA(nmol/mg protein)GSH-Px(U/mg protein)SOD(U/mg protein)CAT(μ mol H2O2decomposed/min mg protein)Control 3.25±0.16 30.52±1.87 1.73±0.24 3.19±0.73 Lycopene 3.94±0.57 32.81±2.20 1.92±0.51 3.42±0.48 Rotenone 6.76±1.6*# 15.53±3.62*# 0.85±0.11*# 1.87±0.62*#Rotenone+lycopene 4.05±1.7△ 28.89±2.65△ 1.62±0.29△ 2.92±0.27△

2.2.2 小鼠右側(cè)紋狀體氧化應(yīng)激指標(biāo) 魚藤酮組小鼠MDA含量顯著高于空白對照和番茄紅素組(P＜0.05,表2),而魚藤酮+番茄紅素組小鼠MDA含量顯著低于魚藤酮組(P＜0.05)。魚藤酮組小鼠GSH-Px和SOD酶活力顯著低于空白對照和番茄紅素組(P＜0.05),而魚藤酮+番茄紅素組小鼠GSHPx和SOD酶活力顯著高于魚藤酮組(P＜0.05)。CAT酶活力在各組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。

Tab.2 Effect of lycopene on lipid peroxidation and antioxidant defense in the right striatum of rotenone treated mice(±s,n=10)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;GSH-Px:Glutathione peroxidase;CAT:Catalase*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs lycopene group;△P＜0.05 vs rotenone group

Group MDA(nmol/mg protein)GSH-Px(U/mg protein)SOD(U/mg protein)CAT(μ mol H2O2decomposed/min/mg protein)Control 19.76±1.52 735.22±41.55 41.58±7.29 4.24±1.49 Lycopene 20.71±0.97 706.77±32.89 43.76±8.49 4.61±1.51 Rotenone 29.39±4.25*# 605.09±53.11*# 28.87±12.37*# 3.28±0.65 Rotenone+lycopene 21.05±1.84△ 728.56±44.57△ 37.98±10.35△ 3.02±0.82

2.3 水迷路神經(jīng)行為分析

實(shí)驗處理后第2、3、4和5周末,分別測量小鼠平均逃逸時間顯示(圖2),魚藤酮組小鼠在第3周末平均逃逸時間顯著高于空白對照和番茄紅素組(P＜0.05),第4和5周末差異極顯著(P＜0.01)。而魚藤酮+番茄紅素組小鼠在第4和5周末平均逃逸時間顯著低于魚藤酮組(P＜0.05)。測量各組小鼠在靶象限活動時間顯示(圖3),魚藤酮組小鼠在第3周末靶象限活動時間顯著高于空白對照和番茄紅素組(P＜0.05),第4和5周末差異極顯著(P＜0.01)。而魚藤酮+番茄紅素組小鼠在第4和5周末的靶象限活動時間顯著低于魚藤酮組(P＜0.05)。其他組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 TH、α-SYN和 LC3-B免疫陽性反應(yīng)比較

TH免疫組化染色顯示,空白對照組(圖4A,5A)和番茄紅素組(圖4B,5B)小鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)及紋狀體可見許多TH陽性神經(jīng)元,細(xì)胞多為錐形或三角形,胞漿內(nèi)棕色顆粒濃,軸突分散在神經(jīng)纖維之間;魚藤酮組小鼠(圖4C,5C)中腦黑質(zhì)TH陽性多巴胺能神經(jīng)元胞體縮小,紋狀體TH陽性細(xì)胞輪廓不清,陽性神經(jīng)纖維脫失,軸突消失。魚藤酮+番茄紅素組小鼠(圖4D,5D,圖4,5見彩圖頁Ⅵ)免疫染色可見中腦黑質(zhì)部位TH陽性神經(jīng)元密集,呈帶狀分布,胞體大,突起明顯。紋狀體TH陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)染色較為淺淡。

Fig.2 The total escape time of different treated groups(±s,n=10)

Fig.3 The activity time of different treated groups(±s,n=10)

α-SYN免疫組化染色顯示,空白對照組(圖6A,7A)和番茄紅素組(圖6B,7B)小鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)及紋狀體僅有較弱的免疫陽性反應(yīng)。而在魚藤酮組(圖6C,7C)小鼠黑質(zhì)及紋狀體α-SYN過度聚集明顯,但沒有觀察到包涵體樣結(jié)構(gòu)。魚藤酮+番茄紅素組小鼠(圖 6D,7D,圖 6,7見彩圖頁Ⅵ)α-SYN免疫染色可見黑質(zhì)部位陽性表達(dá)顯著下降,紋狀體陽性表達(dá)變化不大。

LC3-B免疫組化染色顯示,魚藤酮組小鼠(圖8C,9C)中腦黑質(zhì)致密區(qū)及紋狀體有較強(qiáng)的陽性反應(yīng);而魚藤酮+番茄紅素組小鼠(圖8D,9D)LC3-B免疫染色明顯減弱;空白對照組(圖8A,9A)和番茄紅素組小鼠(圖8B,9B,圖8,9見彩圖頁Ⅵ)中,LC3-B免疫陽性染色幾乎沒有出現(xiàn)。

采集圖像統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),魚藤酮組小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照和番茄紅素組(P＜0.01,表3),α-SYN,LC3-B陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照和番茄紅素組(P＜0.01,表3)。魚藤酮+番茄紅素與魚藤酮組比較,TH陽性神經(jīng)元數(shù)顯著增加,α-SYN,LC3-B陽性神經(jīng)元數(shù)顯著下降(P＜0.05,表3)。其他組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。

采集圖像統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),魚藤酮組小鼠紋狀體TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照和番茄紅素組(P＜0.01,表 4),α-SYN,LC3-B陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照和番茄紅素組(P＜0.01,表4)。魚藤酮+番茄紅素與魚藤酮組比較,TH陽性神經(jīng)元數(shù)有所增加,α-SYN陽性神經(jīng)元數(shù)有所減少,但無顯著性差異(P＞0.05,表4),LC3-B陽性神經(jīng)元數(shù)顯著下降(P＜0.05,表4)。其他組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。

Tab.3 Number of TH,α-SYN and LC3-B immuopositive cells in the substantia nigra of mice(±s,n=10)

Tab.3 Number of TH,α-SYN and LC3-B immuopositive cells in the substantia nigra of mice(±s,n=10)

TH:Tyrosine hydroxylase;α-SYN:α-synuclein;LC3-B:Microtubule-associated protein 3 light chain**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs lycopene group;△P＜0.05 vs rotenone group

Group TH α-SY N LC3-B Control 40.94±3.48 29.40±3.34 8.23±0.84 Lycopene 39.67±7.56 20.44±4.90 11.20±1.25 Rotenone 21.50±2.27**##48.33±8.78**##54.67±9.17**##Rotenone+lycopene28.33±3.39△ 32.67±3.61△ 26.18±4.16△

Tab.4 Number of TH,α-SYN and LC3-B immuopositive cells inthe right striatum of mice(±s,n=10)

Tab.4 Number of TH,α-SYN and LC3-B immuopositive cells inthe right striatum of mice(±s,n=10)

TH:Tyrosine hydroxylase;α-SYN:α-synuclein;LC3-B:Microtubule-associated protein 3 light chain**P＜0.01 vs control and lycopene group;##P＜0.01 vs lycopene group;△P＜0.05 vs rotenone group

Group TH α-SY N LC3-B Control 41.90±4.25 17.30±2.98 7.13±0.65 Lycopene 45.67±1.80 25.22±4.44 7.45±1.25 Rotenone 14.50±4.93**##50.17±8.45**##47.68±7.60**##Rotenone+lycopene17.35±3.42 46.89±4.28 24.20±3.72△

3 討論

魚藤酮具有極強(qiáng)的親脂性,可自由通過血腦屏障和細(xì)胞膜并聚集在細(xì)胞器,選擇性抑制線粒體復(fù)合物I的活性,從而損傷多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)[3]。本實(shí)驗結(jié)果顯示,帕金森小鼠中腦黑質(zhì)和紋狀體組織SOD、GSH-Px和CAT活性相對空白對照組顯著降低,MDA含量顯著升高。該結(jié)果反映帕金森小鼠黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)功能減弱,氧自由基含量增多及細(xì)胞正處于脂質(zhì)過氧化階段,與先前的同類研究類似[9-10]。用番茄紅素干預(yù)后組織中SOD、GSH-Px和CAT活性較帕金森小鼠顯著升高,MDA含量顯著降低,提示番茄紅素可能通過提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量,發(fā)揮其較強(qiáng)的抗氧化作用[6]。水迷路行為結(jié)果顯示,帕金森小鼠平均逃逸時間和靶象限活動時間顯著增加,而給予番茄紅素組干預(yù)后,平均逃逸時間和靶象限活動時間顯著降低。結(jié)果提示,番茄紅素對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用。DA是人腦中重要的神經(jīng)遞質(zhì),主要存在于黑質(zhì)和紋狀體,影響神經(jīng)的傳導(dǎo)功能,在學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用。正常情況下,DA在自氧化或經(jīng)單胺氧化酶催化氧化脫胺代謝過程中產(chǎn)生氧自由基、過氧化氫等細(xì)胞毒性物質(zhì),并能被體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)清除掉。而在氧化應(yīng)激時,由于線粒體受損產(chǎn)生的大量自由基能加速引發(fā)DA自氧化,從而產(chǎn)生大量的過氧化氫和超氧陰離子,另一方面,使黑質(zhì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性下降,線粒體功能損傷,抗氧化系統(tǒng)中酶活性降低,無法清除自由基,使DA神經(jīng)元膜蛋白脂質(zhì)過氧化,最終導(dǎo)致動物行為表現(xiàn)異常。本實(shí)驗結(jié)果顯示,魚藤酮小鼠黑質(zhì)及紋狀體TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少,這可能與實(shí)驗中α-SYN蛋白水平增加有關(guān)。過表達(dá)的α-SYN通過細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷DA能神經(jīng)元,ROS也能對α-SYN蛋白進(jìn)行硝化修飾,而亞硝酸化的α-SYN不僅可以促進(jìn)寡聚體的形成,而且對形成的多聚體有穩(wěn)定作用[5]。番茄紅素干預(yù)組小鼠黑質(zhì)及紋狀體TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,而α-SYN蛋白表達(dá)顯著減少,提示番茄紅素能有效增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力,從而降低魚藤酮對黑質(zhì)及紋狀體DA能神經(jīng)元的毒性。α-SYN蛋白和氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系,它們相互作用、相互影響,共同促進(jìn)PD的病理進(jìn)程。自噬是體內(nèi)降解/再循環(huán)系統(tǒng),也是外源性損傷(如神經(jīng)毒素所致的氧化應(yīng)激狀態(tài))細(xì)胞的一個修復(fù)機(jī)制。本實(shí)驗結(jié)果顯示,帕金森小鼠黑質(zhì)及紋狀體LC3-B表達(dá)顯著增強(qiáng),而番茄紅素組干預(yù)后LC3-B陽性神經(jīng)元數(shù)顯著下降。結(jié)果表明,魚藤酮能激活中腦黑質(zhì)及紋狀體DA能神經(jīng)元的自噬活性,以清除持續(xù)升高的氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的大量氧自由基以及受損的線粒體。Weinreb研究認(rèn)為,細(xì)胞內(nèi)α-SYN蛋白可誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞的死亡和軸突營養(yǎng)不良[4]。在人類路易體癡呆和轉(zhuǎn)基因小鼠突變型α-SYN過表達(dá)的腦組織中LC3-B顯著增加,提示自噬被誘導(dǎo)清除α-SYN寡聚體或突變型α-SYN。進(jìn)一步圍繞氧化應(yīng)激與自噬的激活機(jī)制,對揭示PD等神經(jīng)變性疾病的病因、發(fā)病機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。

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