鹽度、溫度和pH 對2 株海南地衣芽孢桿菌相對蛋白酶活性的影響

朱彥博，唐葉玲，陳圣豐，吳海武，郭偉良，馮永勤，王世鋒，周永燦，謝珍玉

(海南大學 海南省水生生物技術(shù)重點實驗室，海南大學 海洋學院，海南 ?？?570228)

目前，由于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)能產(chǎn)生多種具有重要生物活性的胞外產(chǎn)物，如肽類或非肽類的抗菌物、小分子活性物質(zhì)及多種胞外消化酶［1］，因此，它可促進養(yǎng)殖水體的營養(yǎng)循環(huán)，從而凈化水質(zhì)［2-4］，有效避免了化學藥物的濫用［5-7］，同時還能增強動物的免疫反應(yīng)，提高養(yǎng)殖生物的消化機能［8-14］，所以地衣芽孢桿菌已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中.然而，在凈化水質(zhì)的實際應(yīng)用中，該菌的生長、產(chǎn)酶能力以及胞外產(chǎn)物的活性均會受到復(fù)雜的水質(zhì)環(huán)境因子的影響［15］.為了有效評估培養(yǎng)條件對菌株培養(yǎng)液中蛋白酶活性(包括產(chǎn)酶能力和酶活)的綜合影響，筆者引入了“相對蛋白酶活性”，它是指菌株培養(yǎng)液中的蛋白酶活相對于最佳培養(yǎng)條件下的蛋白酶K 的酶活的大小，同時測定了鹽度、溫度和pH 值3 個主要水質(zhì)環(huán)境因子對分離自海南海水養(yǎng)殖系統(tǒng)的地衣芽胞桿菌(Pb-WC09001、Pb-WC09002)相對蛋白酶活性的影響，以期在海南水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中應(yīng)用這2 個菌株提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種野生型熱帶地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Pb-WC09001、Pb-WC09002，由本實驗室從海南省文昌市的養(yǎng)殖水體中分離、篩選和保存，這2 個菌株表現(xiàn)出較高的蛋白酶活性.

1.1.2 培養(yǎng)基普通海水液體培養(yǎng)基:酵母浸膏1 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，NaCl 30 g·L-1，pH7.5.脫脂牛奶培養(yǎng)基:參考陳圣豐等［16］的方法制備.

1.2 方 法

1.2.1 標準曲線的建立將蛋白酶K(北京全式金生物技術(shù)有限公司，50 U·mg-1)稀釋為80，40，20，10，5，對應(yīng)的酶活分別為80×10-3，40×10-3，20×10-3，10×10-3mg·L-1，5×10-3U·mL-1(最適孵育溫度為58 ℃).分別將20 μL 加入d=4 mm 的脫脂牛奶培養(yǎng)基平板的孵育孔內(nèi)，用封口膠將平板封閉，保持濕度，置于30 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，測量其蛋白酶水解圈直徑，然后建立蛋白酶水解圈直徑(X 軸)與酶活(Y 軸)的標準曲線，用于本試驗中菌體上清液的蛋白酶水解圈直徑換算為最適條件下的蛋白酶K蛋白酶活性.

1.2.2 鹽度對菌株相對蛋白酶活性的影響將2 株高蛋白酶活地衣芽孢桿菌分別接種于不同鹽度(0，10，20，30，40，50)的50 mL 滅菌的普通海水液體培養(yǎng)基中，接種菌落濃度為2×103/mL(下同)，30 ℃150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，按照陳圣豐等［16］的方法制備上清液(下同).

按上法將2 株細菌在不同鹽度下培養(yǎng)的上清液分別加入其對應(yīng)鹽度的脫脂奶平板孵育孔中，30 ℃孵育24 h，觀察和記錄結(jié)果，并將各孔的蛋白酶水解圈直徑換算為最適條件下的蛋白酶K 活性.試驗設(shè)置3個平行組.

1.2.3 溫度對菌株相對蛋白酶活性的影響將菌株分別接種于6 瓶已滅菌的50 mL 普通海水液體培養(yǎng)基中，分別置于6 個溫度為18，22，26，30，34，38 ℃的培養(yǎng)箱中，150 r·min-1培養(yǎng)24 h，并制備成上清液.

試驗組1:在上述6 個溫度梯度下取2 個株菌的上清液20 μL，分別加入脫脂牛奶孵育孔內(nèi)，并置于6個不同溫度的生化培養(yǎng)箱中(各樣品均置于與培養(yǎng)時相同的溫度)孵育24 h，然后觀察和記錄結(jié)果，并計算其相對酶活性.試驗設(shè)置3 個平行組.

試驗組2:加樣方法與試驗組1 相同，不同的是所有平板均置于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育24 h，然后觀察和記錄結(jié)果，并計算其相對酶活性.試驗設(shè)置3 個平行組.

1.2.4 pH 對菌株相對蛋白酶活性的影響配制pH 為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 共7 份不同的普通海水液體培養(yǎng)基，每份50 mL，分別接種Pb-WC09001 和Pb-WC09002 后，30 ℃180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，然后測定不同菌液的上清液的水解圈直徑，并計算其相對酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的建立 不同質(zhì)量濃度的蛋白酶K 的水解圈直徑在(6.30±0.06)mm～(16.32±0.08)mm 之間(見表1)，與廠家標明的酶活(最適條件下)存在明顯的線性關(guān)系，即y=4.826 9x-4.757 6，R2=0.984 9(見圖1).因此，蛋白酶的水解圈直徑與其相對酶活(相對于最適條件下的蛋白酶K)存在良好的線性關(guān)系.

表1 不同質(zhì)量濃度的蛋白酶K 水解圈直徑及酶活

圖1 蛋白酶K 水解圈直徑與酶活性的線性關(guān)系

2.2 鹽度對相對蛋白酶活性的影響 除Pb-WC09002 在鹽度為30 時的相對酶活性略大于其在鹽度為20 時的相對酶活性外，總體而言，2 株細菌的相對蛋白酶活性隨鹽度的增加而逐漸減弱(見表2):在鹽度為0(即淡水)時，相對酶活性最高，分別為3.2 U·mL-1(Pb-WC09001)和3.19 U·mL-1(Pb-WC09002);在鹽度為50 時，僅Pb-WC09001 存在一定的酶活性，相對酶活為1.56 U·mL-1，而Pb-WC09002 完全喪失酶活性.

表2 鹽度對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響

2.3 溫度對相對蛋白酶活性的影響 試驗組1∶Pb-WC09001 的蛋白酶活性隨溫度的升高而逐漸升高，在34 ℃時酶活性最高，相對酶活為3.77 U·mL-1，38 ℃時的酶活性略低于34 ℃時，相對酶活為3.75 U·mL-1;Pb-WC09002 的蛋白酶活性在22 ℃時最低，相對酶活為2.22 U·mL-1，34 ℃時酶活性最高，相對酶活為3.76 U·mL-1(見表3).

表3 溫度對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響(Ⅰ)

試驗組2:在30 ℃孵育條件下，Pb-WC09001 在22 ℃培養(yǎng)時所獲得的上清液的相對酶活性最高，為2.46 U·mL-1，26 ℃時最低，僅為1.33 U·mL-1;Pb-WC09002 在30 ℃培養(yǎng)時所獲得的上清液的相對酶活性最高，為2.74 U·mL-1，在38 ℃時水解圈直徑為0，即沒有酶活(見表4).

表4 溫度對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響(Ⅱ)

2.4 pH 值對相對蛋白酶活性的影響 pH 值對2 株細菌的酶活性存在明顯的影響，pH8.0 時，Pb-WC09001 的上清液的相對酶活性最高，為2.74 U·mL-1，pH6.0 時最低，僅為1.53U·mL-1;pH7.5 時，Pb-WC09002 的上清液的相對酶活性最高，為2.74 U·mL-1，pH9.0 時最低，為0(見表5).

表5 pH 對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響

3 討論

地衣芽孢桿菌能分泌多種高活性的胞外消化酶，主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等水解酶和一些分解植物性餌料中非淀粉多糖的酶類，如果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等［1，17-18］，可將水體中的蛋白質(zhì)、多糖等高聚物變成有利于被其他生物吸收利用的小分子物質(zhì)［19］，常表現(xiàn)出較好的水質(zhì)凈化作用.SOGARRD等［13］也曾報道:地衣芽孢桿菌胞外酶可以降解果膠等某些復(fù)雜的植物性碳水化合物.然而在實際應(yīng)用中，菌體在水體中的生長、產(chǎn)酶活性及其胞外酶活性都會受到鹽度、溫度和pH 值等多種水質(zhì)因子的影響.在本試驗中，雖然Pb-WC09002 在鹽度為30 時的酶活高于鹽度為20 時的酶活，但總體而言，低鹽度下的蛋白酶活性高于高鹽度下的酶活，表明鹽度對該菌的胞外蛋白酶活具有抑制作用，與謝航等［20］的研究結(jié)果基本一致.這可能是由于鹽度改變了細菌培養(yǎng)液的滲透壓，從而影響細菌蛋白酶的表達或釋放，也可能通過影響酶本身的活性而使菌株的表觀酶活下降.溫度也明顯影響地衣芽孢桿菌的相對蛋白酶活性.試驗組Ⅰ的結(jié)果表明，盡管Pb-WC09002 的蛋白酶活性存在一定的波動性，但是，在不同培養(yǎng)溫度下，隨著溫度的升高，Pb-WC09001 和Pb-WC09002 的蛋白酶活的總體趨勢表現(xiàn)為逐步增高，因此，培養(yǎng)溫度對這2株細菌的酶活力起促進作用.試驗組2 的結(jié)果表明，同一菌株在不同培養(yǎng)溫度下獲得的上清液酶活不同，不同菌株在38 ℃的上清液在30 ℃孵育溫度下的酶活差異較大，Pb-WC09002 在38 ℃下獲得的上清液在30 ℃孵育溫度下基本不表現(xiàn)蛋白酶活，而Pb-WC09001 在38 ℃下獲得的上清液在30 ℃孵育溫度下表現(xiàn)較強蛋白酶活，這表明不同菌株在相同溫度下可產(chǎn)生不同的蛋白酶.無論是在低鹽度條件下，還是在低溫條件下，Pb-WC09002 的相對酶活性總體上均高于Pb-WC09001.海南島沿岸水溫在秋季和冬季較低，平均水溫分別為23.22 ℃和18.5 ℃［21］，秋季(9～10 月份)受降雨量的影響，鹽度普遍降低，有些海域，如英潮港，鹽度最低時只有12［22］，因此，Pb-WC09002 更適應(yīng)于水溫和鹽度均較低的季節(jié).到了春末和夏季，海水溫度普遍升高，鹽度也增高，東海岸的清瀾港鹽度高達34.47，西海岸的東方和鶯歌海分別高達36.0和36.2［21］，相對于Pb-WC09002，Pb-WC09001 更適應(yīng)于這些季節(jié).

pH 值也能明顯影響地衣芽孢桿菌胞外蛋白酶的活力.不同菌株在相同pH 值條件下，蛋白酶活性存在顯著差異.pH8.0 時，Pb-WC09001 的酶活性最高，而Pb-WC09002 的酶活卻低于pH7.5 時，pH 9.0 時，Pb-WC09001 的相對酶活為1.56U·mL-1，而Pb-WC09002 的蛋白酶沒有活性，表明Pb-WC09001 對海水環(huán)境(pH8.0～8.4)的適應(yīng)性更高.曹煜成等［15］的研究表明，該菌的蛋白酶水解最適pH 為6.0～9.0，pH9.0 時酶活性最高，彭勇等［23］認為地衣芽孢桿菌胞外蛋白酶的最適pH 為8.0～12.0，在pH 為10.5 時酶活性最高，袁鑄等［24］和黃紅英等［25］則認為，其最適pH 為7.0～11.0，最大酶活力出現(xiàn)在pH 為9.0.這可能是因為該研究分別涉及了不同的地衣芽胞桿菌菌株，而不同菌株的最適pH 值存在差異的緣故，因此，在今后的相關(guān)研究中，應(yīng)對不同的野生型地衣芽孢桿菌開展其最適環(huán)境因子的研究;同時，由于長期的進化，地衣芽孢桿菌很可能存在不同的地理種群，只有本地菌株才能更好地適應(yīng)當?shù)氐乃|(zhì)環(huán)境因子.

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