低氧對發(fā)育期幼鼠大腦皮層GAP-43表達的進行性影響

陳燕 張春來 余廣 趙春玲

（瀘州醫(yī)學(xué)院生理教研室，四川 瀘州 646000）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是兒童常見的睡眠問題，對兒童健康危害較大，在兒童中可引起多種并發(fā)癥［1］。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示［2］，OSAHS在兒童中的發(fā)病率為1%～3%。兒童OSAHS與成人有很大差異，是一個獨立的臨床綜合征。目前，對兒童OSAHS的研究遠沒有成人廣泛，尚有很多問題需要解決。生長相關(guān)蛋白（GAP-43）是研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)的重要標記物之一。目前，許多利用成年大鼠制作的各種腦損傷模型都觀察到GAP-43表達的變化。然而，關(guān)于生長發(fā)育期幼鼠缺氧性腦損傷后，這一反映損傷后修復(fù)的重要指標有何變化，尚未見相關(guān)報道。因此，本實驗選擇21 日齡的幼鼠，通過模擬OSAHS 的典型病理生理特征，建立慢性間斷性低氧（CIH）幼鼠模型，觀察CIH 幼鼠在生長發(fā)育的不同時間點大腦皮層GAP-43表達的變化，以探討這些變化與神經(jīng)元損傷修復(fù)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性21日齡Stragu-Dawley幼鼠60只，體質(zhì)量50±5 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動物科提供（動物合格證號：SYXK（川）2004-065）。隨機分為對照組和慢性間斷性低氧組（CIH 組），每組30只，每組又分為2，4，6w3個時間點，每個時間點10只幼鼠。

1.2 方法

1.2.1 CIH 幼鼠模型復(fù)制

參照楊宇［3］等的方法制作CIH 幼鼠模型。將CIH 組幼鼠每日置于自制的缺氧艙內(nèi)，艙內(nèi)放入大量堿石灰和硅膠以吸收二氧化碳和水蒸氣，艙壁留有小縫隙與艙外相通，使艙內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。實驗期間，每天9∶00a.m.～5∶00p.m.向箱內(nèi)循環(huán)充入氮氣和排出混合空氣，每次循環(huán)6min，通過HBO-2B型控氧儀（浙江建德梅城電化分析儀器廠）監(jiān)測缺氧艙內(nèi)的氧濃度以程控輸氣和排氣裝置，使每一次循環(huán)缺氧艙內(nèi)最低氧濃度為8%，然后排除低氧氣體同時吸入空氣，使氧濃度逐漸恢復(fù)到21%。缺氧艙內(nèi)二氧化碳濃度始終＜3%，溫度保持22±2℃，連續(xù)缺氧直至取材。缺氧期間，大鼠攝食、飲水正常。對照組置于相同的缺氧艙內(nèi)，通入空氣，余處理同CIH 組。

1.2.2 標本制備

每組各時間點大鼠停止處理后，乙醚麻醉，用4%多聚甲醛灌注固定后取腦。在視交叉后緣、大腦腳與橋腦交界處把腦冠狀切為3塊，置于4%多聚甲醛中后固定4h以上，將固定好的腦組織進行常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。

1.2.3 GAP-43免疫組織化學(xué)染色

石蠟連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，進行GAP-43 多克隆抗體的免疫組織化學(xué)標記，步驟如下：加入3%H2O2室溫孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；抗原微波修復(fù)；加入正常山羊血清37℃孵育30min，甩去多余液；滴加兔多克隆抗體GAP-43 50μL（1∶200），4 ℃過夜；滴加即用型二步法非生物素檢測試劑盒中聚合物輔助劑50μL（1∶1）；滴加即用型二步法非生物素檢測試劑盒中的試劑2；DAB顯色5～10min，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封固。陰性對照用PBS液代替一抗，其余處理相同。

1.2.4 GAP-43半定量分析

GAP-43的標記強度用光密度（Optical density，OD）值表示。應(yīng)用Nikon ECLIPSE 88i顯微攝影系統(tǒng)及Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定大鼠大腦皮層GAP-43的吸光度值。各組每一只大鼠腦切片的大腦皮層隨機選取3個400×視野，分別測定其中陽性染色的OD 值，求其平均值，作為該大鼠大腦皮層的OD 值。同時，測定同一張切片上視束的吸光度值作為背景，GAP-43的吸光度值減去背景的吸光度值得到矯正吸光度值，即GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的實際吸光度值。用COD 值進行比較分析，以避免非特異性染色所造成的誤差。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件完成統(tǒng)計處理分析。實驗數(shù)據(jù)采用表示，組內(nèi)前后時間點的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間對應(yīng)時間點的比較采用t檢驗（Independent-samples t test），P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

GAP-43免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色點狀或顆粒狀沉淀，主要分布于大腦皮層神經(jīng)元胞漿中。組間對應(yīng)時間點比較，CIH組各時間點GAP-43的COD 值均高于對照組，差異具有顯著性（P＜0.05）。對照組內(nèi)前后時間點比較，隨著時間增加，GAP-43的COD值逐漸降低；與對照2周組比較，對照4周組和對照6周組GAP-43的COD值明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；而對照4周組與對照6周組比較，GAP-43的COD值差異無顯著性（P＞0.05）。CIH 組內(nèi)前后時間點比較，CIH6周組GAP-43的COD值較CIH2 周組和CIH4 周明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；而CIH2周組與CIH4周比較，GAP-43的COD 值差異無顯著性（P＞0.05），見表1和圖1。

表1 對照組和CIH 組各時間點大腦皮層GAP-43的COD 值（，n＝10）

表1 對照組和CIH 組各時間點大腦皮層GAP-43的COD 值（，n＝10）

注：與對照組對應(yīng)時間點比較，aP＜0.05；與對照2 周組比較，b P＜0.05；與CIH6周組比較，cP＜0.05。

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）可發(fā)生在嬰兒期至青春期任何年齡階段的兒童，2～5 歲為發(fā)病高峰期［2］。大鼠出生后第20～22日齡是大鼠的斷奶期，研究表明［4］，這與人類認知發(fā)育的幼兒期相當。一般將3月～12月齡大鼠稱為成年大鼠，3月齡以前稱為發(fā)育早期大鼠［5］。故本實驗選擇21日齡SD 幼鼠作為實驗對象，將CIH 時間設(shè)定在幼鼠發(fā)育早期，從而觀察CIH 對發(fā)育早期幼鼠大腦皮層GAP-43表達有何影響。

圖1 對照組和CIH 組各時間點大腦皮層GAP-43的陽性表達（×400）

生長相關(guān)蛋白（Growth associated protein-43，GAP-43）是神經(jīng)元特異性蛋白，主要存在于分化定性并開始軸突生長的神經(jīng)元中，在腦功能活躍區(qū)（如：大腦皮質(zhì)、海馬）表達量很高。研究表明［6-9］，在神經(jīng)系統(tǒng)的初期發(fā)育階段中，GAP-43在神經(jīng)元胞漿中的含量較高；隨著腦的發(fā)育成熟，GAP-43的表達逐漸降低；當出現(xiàn)腦損傷時，其表達又會增高。因而將GAP-43 視為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)的重要標記物之一［10］。本實驗觀察到，在生長發(fā)育的各時間點，CIH 幼鼠大腦皮層神經(jīng)元GAP-43表達均較對照組明顯增強，并且表達高峰持續(xù)時間較長（4w），這與其他學(xué)者利用成年大鼠制作的各種腦損傷模型中觀察到GAP-43出現(xiàn)短暫增高（3～14d）不同［9，11］，說明發(fā)育早期大鼠腦損傷后，腦組織自我修復(fù)非常活躍，提示缺氧性腦損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)啟動保護機制并修復(fù)受損的神經(jīng)元，通過GAP-43的不斷增加促進突觸的不斷生長是神經(jīng)進行修復(fù)的重要方式之一。

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