鱟試驗(yàn)測定注射用頭孢雷特中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法學(xué)研究

吳帆 金釗 黃明

（1.四川省達(dá)州市通川中醫(yī)院，四川 達(dá)州 635000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610097；3.四川省食品藥品檢驗(yàn)所，四川 成都 610097）

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是藥品一個(gè)非常重要的安全指標(biāo)，輸液導(dǎo)致熱原超標(biāo)是輸液反應(yīng)的主要原因［1］，近年來，世界各國越來越多地以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替家兔熱原法檢查藥品和生物制品的致熱物質(zhì)越來越普遍。注射用頭孢雷特臨床適應(yīng)于革蘭氏陰性菌引起的肌骨感染、呼吸道感染、尿道感染及心內(nèi)膜炎等?！吨袊幍洹?010年版尚未收載該品種。為此，特對(duì)注射用頭孢雷特進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

注射用頭孢雷特（四川抗菌素工業(yè)研究所1.0g，批號(hào)：090911，090912，090913），細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-200860，160EU·支-1）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：0911060）；鱟試劑（湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.5EU· ml-1，批號(hào)：0909042），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.5EU·ml-1，批號(hào)：0912210）

1.2 方法

1.2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復(fù)核

按照《中國藥典》［2］附錄規(guī)定的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的鱟試劑（TAL）進(jìn)行靈敏度復(fù)核。結(jié)果鱟試劑的實(shí)測靈敏度均在0.5～2.0λ之間，符合規(guī)定。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)取λ作為鱟試劑的靈敏度。

1.2.2 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參照《中國藥典》確定樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L），L=K·M-1，K 為人用每千克體重每小時(shí)最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，非放射性藥品靜脈途徑給藥時(shí) K 值為5EU·（kg·h-1），M 為人用每千克體重每小時(shí)給藥最大劑量。注射用頭孢雷特成人最大劑量2000 mg·（kg-1·h-1）。綜合生產(chǎn)、臨床用藥和檢驗(yàn)的實(shí)際情況，將注射用頭孢雷特的L值定為0.5EU·mg-1。

1.2.3 樣品的干擾試驗(yàn)

用λ=0.5EU·ml-1鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，取1.2.1項(xiàng)下鱟試劑，分別對(duì)1批已檢測細(xì)菌內(nèi)毒素不超標(biāo)的樣品進(jìn)行4、2和1 mg·ml-1濃度（批號(hào)：09011），進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)。樣品在表1 所述3 種濃度下，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾，故正式實(shí)驗(yàn)將樣品稀釋為4mg·ml-1和2mg·ml-1，并取2個(gè)廠家靈敏度為0.5EU·ml-1的鱟試劑，參照有關(guān)文獻(xiàn)［3］按靈敏度復(fù)核方法對(duì)樣品稀釋為4mg·ml-1和2mg·ml-1濃度進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算以樣品稀釋液配制的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何均值（Et）及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制的內(nèi)毒素溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何均值（Es）。

1.2.4 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢查

取上述3批注射用頭孢雷特稀釋為2mg·ml-1的濃度，以λ=0.5EU·ml-1的鱟試劑，按常規(guī)凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2 結(jié)果

注射用頭孢雷特稀釋為4mg·ml-1和2mg·ml-1濃度進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，其Et與相應(yīng)的Es均在0.5～2.0之間，且Es在0.5～2.0λ之間，表明此時(shí)樣品在4mg·ml-1和2mg·ml-1濃度對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾，見表2。上述3批注射用頭孢雷特中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于0.25EU·mg-1，見表3。

表1 樣品的干擾預(yù)試驗(yàn)（EU·ml－1）

3 討論

凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測［4］，要求在適宜的溫度、pH 值及無干擾作用時(shí)鱟試劑能與微量的細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)形成凝膠，通過肉眼觀察結(jié)果。在建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法時(shí)，首先要確定其細(xì)菌內(nèi)毒素限值，還要求至少取3批樣品，并應(yīng)用2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的干擾試驗(yàn)，確認(rèn)樣品在某一濃度下不會(huì)干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查［2］，本品根據(jù)注射用頭孢雷特最大臨床的規(guī)定劑量，確定其細(xì)菌內(nèi)毒素限值為內(nèi)毒素應(yīng)小于0.25EU·mg-1，并應(yīng)用2個(gè)廠家鱟試劑對(duì)3批注射用頭孢雷特樣品進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾試驗(yàn)，結(jié)果當(dāng)樣品濃度為2mg·ml-1，對(duì)鱟試驗(yàn)檢查無干擾作用。從而證實(shí)可以建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值應(yīng)小于0.25EU·mg-1。

表2 樣品的干擾試驗(yàn)（EU·ml－1）

表3 樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢查

1 孫佩芳，王春江，王建民，等.5年輸液反應(yīng)送檢結(jié)果分析［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2002，22（2）：122-123.

2 中華人民共和國國家藥典委員會(huì).中國藥典［S］，二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010，附錄99-102.

3 肖貴南，李瑾翡，吳招娣.鱟試驗(yàn)測定乙酰谷酰胺氯化鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素［J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21（40）：390-391.

4 劉華，徐曉霞，別小琳.鱟試驗(yàn)測定復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素［J］.四川生理科學(xué)雜志，2007，29（1）：39-40.