siRNA沉默HIF-1α對(duì)大鼠心肌細(xì)胞CT-1表達(dá)的影響

王 晗，符史干，董戰(zhàn)玲，許閩廣，王 楊，陳國(guó)斌，高凌峰

(海南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，海南海口571199)

低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個(gè)亞單位組成，HIF-1α的穩(wěn)定性受環(huán)境中氧的水平的調(diào)節(jié)，而β亞單位則不受氧的影響［1］。正常氧分壓條件下，HIF-1α通過(guò)泛素-蛋白酶小體途徑被降解，當(dāng)氧分壓降低時(shí)，HIF-1α降解途徑被阻斷，在胞質(zhì)中聚集，轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與β亞單位聚合后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。

心臟營(yíng)養(yǎng)素-1(Cardiotrophin-1，CT-1)是IL-6家族成員之一，CT-1可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，缺血性心臟病中CT-1表達(dá)增加，體現(xiàn)代償性保護(hù)作用［2］。在心肌細(xì)胞低氧情況下，CT-1表達(dá)是否受到低氧激活的HIF-1調(diào)控尚不清楚。因此，本研究合成了干擾HIF-1α的siRNA片段，通過(guò)轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞系H9C2，探討了HIF-1α基因沉默對(duì)低氧心肌細(xì)胞中CT-1基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細(xì)胞系H9C2(上海越研生物科技有限公司)，氯化鈷(CoCl2)(海南青鳥生物科技有限公司)，Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)(廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司)。Trizol試劑、脂質(zhì)體lipofactamine 2000(invitrogen公司)，siRNA片段(廣州銳博生物公司合成)，PCR相關(guān)試劑(博大泰克公司)，HIF-1α抗體、CT-1抗體和 actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與低氧孵育:H9C2細(xì)胞系在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37℃，5%CO2孵箱中。低氧環(huán)境通過(guò)在培養(yǎng)基中加入CoCl2實(shí)現(xiàn)。

1.2.2 細(xì)胞存活檢測(cè):H9C2細(xì)胞存活率通過(guò)Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)檢測(cè)。種植于96孔板的細(xì)胞，按照每孔100 μL培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8溶液的比例進(jìn)行孵育，2 h后，檢測(cè)A450。

1.2.3 RNA干擾:轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。按照l(shuí)ipofectamine2000的說(shuō)明書將siRNA片段轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用siRNA片段如下:si-HIF-1α(正義鏈):5'-GATCCCGCACAGTTACAGTATTCCATCAAGAGTG GAATACTGTAACTGTGCTTTT TT-3';si-HIF-1α(反義鏈):5'-C TAGAAAAAAGCACAGTTACAGTATTCC ACTCTTGATGGAATACTGTAACTGTGCGG-3'。對(duì)照的siRNA片段:si-control(正義鏈):5'-GATCCCGTC GCGACTATAGAGTAAGTCAAGAGCTTACTCTATAGT CGCGACTTTTTT-3';si-control(反義鏈):5'-CTAGA AAAAAGTCGCGACTATAGAGTAAGCTCTTGACTTAC TCTATAGTCGCGACGG-3'。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)干擾效果:Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA。Real-time PCR擴(kuò)增過(guò)程及熒光信號(hào)檢查、數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和分析均由儀器(ABI Prism 7300 sequence detection system(PE Applied Biosystems公司)及自帶的SDS軟件自動(dòng)完成。PCR反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性10 min，95℃ 10 s、64℃ 5 s、72℃ 20 s，共34個(gè)循環(huán)。溶解曲線與瓊脂糖電泳相結(jié)合確定擴(kuò)增的目的片段的大小。actin作為內(nèi)對(duì)照來(lái)評(píng)估HIF-1α mRNA和CT-1 mRNA的表達(dá)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白和CT-1蛋白水平的表達(dá):收集細(xì)胞后加入裂解液各200 μL，經(jīng)8%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，蛋白封閉液封閉膜4℃過(guò)夜;一抗為小鼠抗大鼠HIF-1α單克隆抗體(1∶500稀釋)，室溫?fù)u床孵育2 h，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，化學(xué)熒光顯色。actin作為內(nèi)對(duì)照，一抗為小鼠抗大鼠肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(1∶500稀釋)，余條件同 HIF-1α。CT-1蛋白水平檢測(cè)方法同HIF-1α。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，配對(duì)組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2模擬低氧合并siRNA-HIF-1α轉(zhuǎn)染時(shí)CT-1在心肌細(xì)胞系H9C2中表達(dá)情況

2.1.1 Real-time PCR檢測(cè)siRNA-HIF-1α的干擾效果及對(duì)CT-1 mRNA水平的影響:在100 μmol/L CoCl2處理48 h模擬低氧條件下，干擾組(轉(zhuǎn)染干擾HIF-1α siRNA的H9C2)中HIF-1α mRNA比對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)義干擾片段的H9C2)明顯減少(P＜0.05)(圖1)。低氧情況下轉(zhuǎn)染無(wú)義干擾片段的H9C2細(xì)胞中CT-1基因mRNA表達(dá)較常氧情況下未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯增高(P＜0.05)，而低氧情況下干擾組(轉(zhuǎn)染干擾HIF-1α siRNA的H9C2)中的CT-1 mRNA比對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)義干擾片段的 H9C2)明顯減少(P＜0.05)(圖2)。

2.1.2 Western blot檢測(cè)siRNA對(duì)HIF-1α蛋白和CT-1蛋白的影響:在低氧情況下干擾組細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)為 0.46±0.05，較對(duì)照組的0.74±0.03明顯減少 (P＜0.05)，干擾組細(xì)胞中CT-1蛋白的表達(dá)為0.68±0.12，也較對(duì)照組的1.08±0.08明顯減少 (P＜0.05)(圖3)。

圖3 干擾HIF-1α的siRNA對(duì)HIF-1α蛋白和CT-1蛋白的影響Fig 3 Effect of RNA interference on HIF-1α and CT-1 protein expression

2.2 CoCl2模擬低氧合并siRNA-HIF-1α轉(zhuǎn)染時(shí)H9C2細(xì)胞的增殖情況

隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸增加，使用CoCl2后細(xì)胞存活率均較常氧條件下下降，且使用CoCl296 h模擬低氧條件下，干擾組比對(duì)照組細(xì)胞存活率下降(P＜0.05)(圖4)。

圖4 CCK-8試劑盒檢測(cè)干擾HIF-1α基因后H9C2細(xì)胞的增殖情況Fig 4 Effect of HIF-1α gene silencing on viability of H9C2 cells by Cell Counting Kit-8

2.3 CoCl2模擬低氧時(shí)CT-1在心肌細(xì)胞系H9C2中的表達(dá)情況

2.3.1 低氧后HIF-1α mRNA和CT-1 mRNA的表達(dá)水平的變化:H9C2在未經(jīng)CoCl2處理，即常氧情況下HIF-1α mRNA就存在較高的表達(dá)，在CoCl2模擬的低氧條件下，HIF-1α mRNA較常氧時(shí)無(wú)顯著差異，CT-1 mRNA較常氧時(shí)顯著增加(P＜0.05)(表1)。

表1 CoCl2處理細(xì)胞后HIF-1α和CT-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 1 Relative expression of HIF-1α and CT-1 mRNA by treating cells with CoCl2

2.3.2 使用CoCl2后HIF-1α蛋白和CT-1蛋白表達(dá)水平的變化:常氧情況下HIF-1α蛋白水平為2.39×10－3±2×10－4，低氧后蛋白水平為 0.34 ±0.06，較常氧時(shí)明顯增高(P＜0.05)。常氧情況下CT-1蛋白有一定的表達(dá)，為0.34±0.05，低氧后CT-1蛋白水平為0.55±0.05，較常氧時(shí)明顯增高(P＜0.05)(圖5)。

圖5 CoCl2處理細(xì)胞后HIF-1α和CT-1蛋白表達(dá)的改變Fig 5 Expression of HIF-1α and CT-1 protein by treating cells with CoCl2

3 討論

HIF-1是低氧條件下激活的最主要的轉(zhuǎn)錄因子，能與促紅細(xì)胞生成素基因上的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response elements，HRE)結(jié)合從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄［3］，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管舒縮、腫瘤耐藥等方面發(fā)揮重要作用［4］。HIF-1還參與缺血時(shí)的心肌代謝和血管新生過(guò)程［5］。雖然調(diào)節(jié)HIF-1活性的機(jī)制很多，但氧誘導(dǎo)的羥化酶的作用是調(diào)節(jié)HIF-1的最主要的方向。HIF-1的兩個(gè)亞單位中HIF-1α的氧依賴區(qū) (ODD)與靶基因啟動(dòng)子DNA的結(jié)合增強(qiáng)了其轉(zhuǎn)錄活性，因此該研究選擇HIF-1α基因作為研究對(duì)象，探討低氧情況下心肌進(jìn)行代償?shù)目赡軝C(jī)制。

該研究中設(shè)計(jì)了1對(duì)HIF-1α-siRNA寡核苷酸片段，通過(guò)化學(xué)合成并轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞系H9C2，實(shí)時(shí)定量PCR和 Western blot鑒定結(jié)果顯示，HIF-1αsiRNA對(duì)HIF-1α的抑制效果顯著，表達(dá)量較對(duì)照組有顯著性差異。

CT-1是從小鼠的囊胚內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)中獲取全能胚胎干細(xì)胞，然后建立胚胎小體cDNA文庫(kù)，逐級(jí)篩選、分離，最后克隆出的一個(gè)新的蛋白質(zhì)［6－7］。CT-1在生理病理過(guò)程中起重要作用，例如代償腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor，TNF-α)所致的損傷、參與肝細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)元的存活等［8］。近年來(lái)，CT-1作為心肌肥大、心衰和心肌重構(gòu)的主要細(xì)胞因子之一被廣泛研究。在鼠心肌梗死模型中，CT-1在保護(hù)心肌受損過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［9］。CT-1在小鼠胚胎細(xì)胞中受 HIF-1的調(diào)控［10］。在缺血低氧性心臟病中，HIF-1主要通過(guò)上調(diào)VEGF、iNOS 的表達(dá)發(fā)揮代償作用［11］，HIF-1 是否也能通過(guò)上調(diào)CT-1的表達(dá)使心肌存活率增加值得探討。

低氧環(huán)境下，HIF-1α mRNA無(wú)明顯變化，蛋白水平增加，符合低氧誘導(dǎo) HIF-1α表達(dá)的機(jī)制，HIF-1α蛋白增加伴隨著CT-1 mRNA和蛋白水平的升高。該研究檢測(cè)了siRNA干擾HIF-1α基因后，心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞中HIF-1α基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明，當(dāng)HIF-1α被抑制后，CT-1的上調(diào)機(jī)制被阻斷，細(xì)胞CT-1的表達(dá)無(wú)論從mRNA水平或蛋白質(zhì)水平都明顯減低，反之，說(shuō)明低氧條件下CT-1基因的上調(diào)作用有可能是通過(guò)低氧激活HIF-1α而誘導(dǎo)產(chǎn)生的。

該研究通過(guò)干擾H9C2細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)及研究HIF-1α對(duì)CT-1基因的調(diào)控作用，為低氧情況下心肌的代償機(jī)制提供新的見(jiàn)解和實(shí)驗(yàn)資料，對(duì)治療缺血性心臟病提供新的思路。

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