CGRP減輕高氧誘導的早產(chǎn)鼠肺泡Ⅱ型細胞損傷及對Gli1表達的影響

黨紅星，楊 林，王少華，2，方 芳，許 峰*

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學科兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室兒科學重慶市重點實驗室重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地，重慶400014;2.深圳市福田區(qū)婦幼保健院兒科，廣東深圳518045)

高濃度氧療是挽救危重新生兒的重要手段，但較長時間吸入高氧容易導致急性肺損傷(hyperoxia aute lung injury，HALI)和支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)。HALI和 BPD 已成為早產(chǎn)和低體重新生兒致死致殘的重要原因［1］。肺泡Ⅱ型上皮細胞(typeⅡalveolar epithelial cell，AECⅡ)具有干細胞樣功能，其自我修復對肺泡的形成和分化起重要作用［2］。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是廣泛分布于人體各組織的神經(jīng)肽類遞質(zhì)，能誘導多種細胞的增殖與分化，并參與了胚胎肺發(fā)育的進程，對肺泡上皮有一定保護和刺激增殖的作用［3］。Sonic hedgehog(Shh)信號通路與細胞遷移、增殖、分化和凋亡密切相關(guān)，也是胚胎期肺臟結(jié)構(gòu)形成和發(fā)育過程中至關(guān)重要的信號通路［4－5］。本研究通過觀察95%O2條件下，CGRP對AECⅡ氧化損傷的影響及Shh信號通路中核轉(zhuǎn)錄因子Gli1的表達變化，旨在探討高氧對AECⅡ的損傷及CGRP的保護作用是否涉及Shh信號通路，以期進一步探索HALI的發(fā)生和修復機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

SPF級孕19 d SD大鼠［第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，合格證號 SCXK:(渝)2007-0005］;胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、DMEM/F12 培養(yǎng)基(Hyclone公司);膠原酶 I、DEPC(Sigma公司);DNA酶I(北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司);大鼠αCGRP、CGRP 拮抗劑(CGRP8-37)(Anaspec公司);活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物);BCA蛋白定量檢測試劑盒(北京百泰克公司);引物探針、RT試劑、SYBR green I、熒光定量PCR試劑(ShineGene公司);RIPA裂解液、PMSF(北京普利萊生物);PVDF膜(Millipore公司)、辣根過氧化物酶(HRP)標記抗兔二抗(武漢博士德公司);Gli1和GAPDH一抗(Abbiotec公司)。

1.2 原代AECⅡ培養(yǎng)

早產(chǎn)大鼠AECⅡ的分離、培養(yǎng)與鑒定參照本研究室的原創(chuàng)方法進行［6］。細胞貼壁生長18 h后接近增殖狀態(tài)，活性良好，用于實驗。

1.3 AECⅡ高氧損傷模型的建立及實驗分組

將AECⅡ分為6組:1)空氣組;2)空氣+CGRP組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入10－8mol/L的CGRP;3)空氣+CGRP及其拮抗劑組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入CGRP和10－7mol/L的 CGRP8-37;4)高氧組:置于密閉氧倉，通入5%CO2和95%O2的混合氣體;5)高氧+CGRP組:培養(yǎng)液中預(yù)先加入 CGRP;6)高氧 +CGRP及其拮抗劑組:培養(yǎng)液中加入 CGRP和CGRP8-37，然后按高氧組處理。各組細胞培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.4 檢測指標和方法

1.4.1 細胞凋亡率:細胞培養(yǎng)24 h后，消化并收集各組細胞，以PBS洗滌，緩沖液重懸后，按試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI，室溫下避光孵育15 min，在流式細胞檢測儀上測定細胞凋亡率。

1.4.2 細胞內(nèi) ROS活性:按試劑盒說明書，以DCFH-DA分子探針重懸細胞，37℃孵育25 min后DMEM洗滌，使用488 nm的激發(fā)波長，522 nm的發(fā)射波長在流式細胞儀上檢測各組熒光強度。

1.4.3 細胞內(nèi)MDA和SOD活性:將細胞懸液制成勻漿，按試劑盒說明書，分別于波長532 nm和550 nm處在紫外分光光度儀上測定吸光度 (A)值，按照與標準品A值的比值計算細胞MDA和SOD值。

1.4.4 實時熒光定量PCR檢測表面活性蛋白(surfactant protein，SPC)mRNA表達:Trizol試劑提取AECⅡ總RNA，測定RNA純度和濃度。用兩步法:第1步反轉(zhuǎn)錄，按試劑盒說明書利用隨即引物將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件:25℃ 10 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min。第2步real-time PCR反應(yīng):以SPC和β-actin為引物(表1)，在實時熒光定量PCR儀上進行。反應(yīng)條件:94℃ 4 min;94℃20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s;循環(huán)35次。每個樣本重復6次，記錄觀察擴增曲線和溶解曲線，確定各擴增產(chǎn)物為特異性目的基因，在曲線上讀出CT值，以β-actin為內(nèi)參照，用 2－ΔΔCT法計算 SPC mRNA 的相對表達量。

表1 PCR引物序列和擴增片段Table 1 The oligonucleotide primers and amplified product of PCR

1.4.5 Western blot檢測Gli1蛋白:收集各組細胞，用RIPA裂解液和PMSF提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。每個樣品取50 μg總蛋白，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳，0.8 mA/cm2條件半干電轉(zhuǎn)移2 h至PVDF膜，封閉洗膜后再加入1∶100稀釋的兔抗Gli1和GAPDH一抗，4℃孵育過夜后洗去一抗，以1∶3 000稀釋的HRP標記的抗兔二抗37℃孵育2 h，洗膜后ECL化學發(fā)光法膠片曝光掃描。確定特異性條帶后用Quantity One 4.6軟件進行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，目的條帶與內(nèi)參條帶的積分吸光度(AU)比值為最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學改變

倒置顯微鏡下觀察，AECⅡ在空氣各組狀態(tài)類似，生長活躍，島狀分布，細胞貼壁伸展，細胞間連接緊密，呈多角形、橢圓形或立方形，胞質(zhì)豐富，透亮度高，板層小體清晰可見;高氧組細胞數(shù)量顯著減少，分布稀疏，停止生長，板層小體基本消失，部分細胞收縮，細胞間隙變大，脫壁細胞較多;CGRP處理后活細胞數(shù)量較高氧組明顯增加，細胞形態(tài)接近空氣組，板層小體可見;CGRP拮抗劑組AECⅡ形態(tài)學改變較高氧組嚴重，活細胞數(shù)量顯著減少，空泡變性明顯，細胞脫壁較嚴重，板層小體明顯減少或消失。

2.2 CGRP對高氧誘導下AECⅡ凋亡的影響

高氧組AECⅡ凋亡率顯著增加，是空氣對照組的3.6倍(P＜0.05);但經(jīng)CGRP處理后凋亡率明顯下降(P＜0.05);而使用CGRP拮抗劑后凋亡率又較CGRP處理組增加(P＜0.05)(圖1，表2)。

圖1 流式細胞術(shù)檢測AECⅡ凋亡Fig 1 Apoptosis of the alveolar epithelial cells typeⅡdetected by flow cytometry

表2 高氧誘導及CGRP干預(yù)對AECⅡ凋亡及氧化損傷的影響Table 2 Effect of hyperoxia and CGRP on apoptosis and oxidative stress injury in the alveolar epithelial cells typeⅡ(，n=6)

表2 高氧誘導及CGRP干預(yù)對AECⅡ凋亡及氧化損傷的影響Table 2 Effect of hyperoxia and CGRP on apoptosis and oxidative stress injury in the alveolar epithelial cells typeⅡ(，n=6)

＊P＜0.05 compared with air group;#P ＜0.05 compared with hyperoxia group;△P ＜0.05 compared with hyperoxia+CGRP group．

group apoptosis(%) ROS(AU) MDA(μmol/L) SOD(kU/L)air 9.3±3.4 19.28±4.2 1.92±0.3 53.35±9.4 air+CGRP 9.7±4.1 21.35±3.6 2.12±0.4 54.34±8.9 air+CGRP+CGRP8-37 10.2±3.9 22.8±3.6 2.23±0.4 52.96±9.3 hyperoxia 33.6±6.8* 49.87±5.1* 3.18±0.5* 27.62±6.1*hyperoxia+CGRP 18.8±4.7# 36.45±4.3# 2.24±0.4# 44.35±7.8#hyperoxia+CGRP8-37 41.9±8.3△ 45.8±5.9△ 2.93±0.5△ 23.23±5.5△

2.3 CGRP對高氧誘導下AECⅡ內(nèi)ROS、MDA和SOD的影響

高氧組細胞內(nèi)ROS水平較空氣對照組增加約1.5倍(P＜0.05)，MDA增加近65%(P＜0.05)，SOD活性降低近一半(P＜0.05);CGRP處理后ROS和MDA顯著下降(P＜0.05)，SOD活性明顯上升(P＜0.05);而使用CGRP拮抗劑后，ROS水平和MDA活性較CGRP處理組顯著升高(P＜0.05)，SOD則顯著下降(P＜0.05)，甚至低于高氧組水平(表2)。

2.4 CGRP對高氧誘導下AECⅡSPC mRNA表達的影響

空氣條件下的3組細胞的SPC mRNA表達水平無明顯改變。與空氣組比較，高氧誘導后細胞SPC mRNA表達水平降低近2/3(P＜0.05);經(jīng)CGRP處理后SPC mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05);而CGRP拮抗劑干預(yù)后其表達水平又降低近1/2(P＜0.05)(表3)。

2.5 CGRP對高氧誘導下AECⅡ Gli1蛋白表達的影響

空氣條件下3組AECⅡ的Gli1蛋白表達水平無明顯差異。高氧誘導下，Gli1蛋白表達下降近3/4(P＜0.05);而CGRP處理后Gli1蛋白表達升高近1倍(P＜0.05);但使用 CGRP拮抗劑干預(yù)后，與CGRP組比較，Gli1蛋白表達水平顯著下降(P＜0.05)，并遠低于高氧組水平(圖2，表3)。

3 討論

早期HALI發(fā)生的主要原因是肺泡上皮和毛細血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并引起呼吸膜破壞和炎性細胞浸潤，繼之出現(xiàn)肺泡異常修復和肺間質(zhì)非特異性增生，即BPD的發(fā)生［7］。肺泡上皮結(jié)構(gòu)和功能的修復完全依賴于AECⅡ，它在逆轉(zhuǎn)肺纖維化過程中起關(guān)鍵作用，AECⅡ的功能狀態(tài)直接決定肺損傷后的轉(zhuǎn)歸［8］。目前盡管HALI發(fā)生的精確機制仍不十分清楚，但過度的氧化應(yīng)激被認為是其中心環(huán)節(jié)，氧自由基和炎性反應(yīng)可通過各種途徑導致AECⅡ損傷和過度凋亡［9－10］。本研究證實了95%O2可使AECⅡ氧化抗氧化系統(tǒng)失衡，并導致嚴重的細胞損傷和功能失調(diào)。

表3 高氧誘導及CGRP干預(yù)對AECⅡSPC mRNA及Gli1蛋白表達的影響Table 3 The effect of hyperoxia and CGRP on expressions of SPC mRAN and Gli1 protien in the alveolar epithelial cells typeⅡ(，×10－3，n=6)

表3 高氧誘導及CGRP干預(yù)對AECⅡSPC mRNA及Gli1蛋白表達的影響Table 3 The effect of hyperoxia and CGRP on expressions of SPC mRAN and Gli1 protien in the alveolar epithelial cells typeⅡ(，×10－3，n=6)

＊P＜0.05 compared with air group;#P ＜0.05 compared with hyperoxia group;△P ＜0.05 compared with hyperoxia+CGRP group．

group SPC mRNA(relative quantity)Gli1 protein/GADPH(AU)air 47.2±5.3 311.5±54.2 air+CGRP 51.4±6.3 342.6±58.3 air+CGRP+CGRP8-37 44.8±5.7 286.3±49.5 hyperoxia 19.4±2.6* 83.5±19.6*hyperoxia+CGRP 30.7±4.7# 168.4±33.2#hyperoxia+CGRP8-37 16.2±2.9△ 24.6±7.3△

圖2 各組AECⅡGli1蛋白質(zhì)免疫印跡Fig 1 Western blot to test Gli1 protein

CGRP是一種含37個氨基酸殘基的神經(jīng)肽。最初發(fā)現(xiàn)其主要作用是使微血管擴張，正因為如此，CGRP長期被認為是炎性反應(yīng)的誘發(fā)因子。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)CGRP在保護肌肉、腎臟、胃黏膜、胰島B細胞和肝細胞等免受ROS引起的氧化損害中起著重要的作用［11－12］。在肺臟，肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分泌CGRP對支氣管創(chuàng)傷的修復起著重要作用，而在炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激條件下，AECⅡ本身也可產(chǎn)生和分泌CGRP，且具有免疫調(diào)節(jié)，支氣管保護，促進上皮和內(nèi)皮增殖的作用，并與很多呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)［3，13］。本研究發(fā)現(xiàn)，CGRP 對 95%O2處理的AECⅡ可通過抑制ROS水平、調(diào)節(jié)氧化抗氧化酶活性緩解氧化應(yīng)激導致的細胞凋亡和損害，并促進細胞增殖，部分恢復SPC表達的能力。

Shh信號通路是調(diào)節(jié)器官發(fā)育和細胞增殖的重要信號通路，該信號通路紊亂可導致器官發(fā)育障礙或腫瘤發(fā)生［5］。Glil是Shh信號通路最重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在絕大多數(shù)情況下對Shh信號通路起正調(diào)節(jié)作用，可將Shh信號傳導至核內(nèi)靶基因，并起到轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵作用［14］。已知在正常發(fā)育肺的肺泡上皮細胞有Shh信號的激活［15］，本研究發(fā)現(xiàn)高氧能抑制AECⅡ的Gli1活性，CGRP在高氧條件下則具有保護或促進Gli1信號分子表達的作用，但使用CGRP拮抗劑后，該保護或促進作用明顯減弱，而且這種改變與同條件下細胞氧化損害程度，氧化和抗氧化酶活性及SPC表達的改變大致同步。說明Gli可能與高氧誘導的AECⅡ損傷修復及細胞功能狀態(tài)密切相關(guān)，提示在HALI和BPD發(fā)生發(fā)展過程中有Shh信號通路的改變，CGRP可能直接或間接參與了對Shh信號通路的調(diào)控。本研究提示的Shh信號通路中Gli1分子的變化可能為HALI和BPD的防治提示了新的研究靶點。然而由于細胞的信號網(wǎng)絡(luò)是及其復雜的系統(tǒng)，多條信號通路和多種信號分子交互作用，Shh信號通路在氧化損害中的角色以及與CGRP的定位關(guān)系目前尚不清楚，進一步研究將使用RNA干擾技術(shù)和基因敲除動物進行更深入的探索。

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