溫陽通脈方對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響及其信號傳導(dǎo)途徑

李彬彬，石月萍

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

心肌梗死是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。隨著急診溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)等再灌注治療方法的推廣，可有效恢復(fù)缺血心肌的血供和營養(yǎng)支持。但再灌注治療在恢復(fù)心肌血供的同時也帶來心肌的缺血-再灌注 損 傷 (myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)。心肌缺血-再灌注損傷是缺血心肌再灌注之后一種嚴(yán)重的甚至致命的病理生理改變，所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡以往多認(rèn)為是壞死，但近年來大量研究表明，細(xì)胞凋亡也是參與MI/RI中的重要組成部分，其發(fā)生、發(fā)展還受多種基因調(diào)控，通過干預(yù)凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，可減輕MI/RI，達(dá)到保護(hù)心肌的目的[1-5]。古今大量臨床實踐已證實中醫(yī)藥能夠有效治療冠心病。因此，探索中醫(yī)藥防治心肌細(xì)胞凋亡成為防治冠心病新的著眼點。本實驗研究中藥溫陽通脈方對大鼠心肌缺血-再灌注的影響，探討其心肌保護(hù)機制。

材料和方法

1 動物 體質(zhì)量250~300 g健康雄性SD大鼠36只，隨機分為3組，每組12只，購于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

2 藥品、試劑及儀器 溫陽通脈方中藥免煎劑：人參、三七、桂枝、枳實、瓜蔞、薤白等，訂購于華潤三九醫(yī)藥股份有限公司(生產(chǎn)批號：1101082S)；蛋白激酶b試劑盒，訂購于北京中杉金橋試劑有限公司；凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒，訂購于南京凱基公司。MCE-1000心電監(jiān)護(hù)儀(深圳遼瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；DH-150型動物人工呼吸機(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實驗廠)；HC-3018高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)；數(shù)碼照像機；全自動生化檢測儀(日本日立7170A)。

3 分組及給藥 IR組：0.9%氯化鈉注射液灌胃(每只2 ml)2周后穿線結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后松開結(jié)扎線，使之再灌注120 min；WTF組：中藥免煎劑用0.9%氯化鈉注射液稀釋到合適比例灌胃2周，后穿線結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后松開結(jié)扎線，使之再灌注120 min；WTF+BA組：中藥免煎劑用0.9%氯化鈉注射液稀釋到合適比例灌胃2周，后穿線結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后經(jīng)尾靜脈注射阻滯劑LY294002后松開結(jié)扎線，使之再灌注120 min。

4 大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)再灌注模型的建立 大鼠用20%烏拉坦0.5 ml/kg行腹腔麻醉后于動物手術(shù)臺固定，取頸正中切口，分離頸總動脈備實驗過程中動脈插管取血，氣管插管進(jìn)行機械通氣(呼吸頻率：60/min；潮氣量：10~15 ml；呼吸比1∶3)；于胸骨左旁第2~3肋間行縱行切口，分離胸大肌及肋間肌，結(jié)扎肋間動靜脈，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜，暴露心臟；在左心耳下緣與肺動脈圓錐間左冠狀動脈前降支起始部使用帶6.0Prolene線的縫合針，自左心室側(cè)穿入，由肺動脈圓錐側(cè)穿出，留線暫不結(jié)扎，待血壓、呼吸穩(wěn)定10~15 min后再收緊結(jié)扎線，結(jié)扎之前在預(yù)結(jié)扎的冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)處放置一根約0.5 cm長直徑1.5 mm的乳膠管；供血區(qū)心肌顏色由鮮紅轉(zhuǎn)為暗紫，心電圖示ST段弓背向上抬高＞0.5 mV，局部心肌變成紫紅色并有節(jié)段性運動不良，證實閉塞有效。缺血30 min后剪斷結(jié)扎線，使冠狀動脈再通，形成再灌注狀態(tài)，松開結(jié)扎線前后ST-T峰值下降50%以上，局部心肌變紅，為AMI再灌注模型成功，再灌注120 min后處死動物。

5 心肌梗死范圍測定 再灌注120 min后處死動物立即取出心臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗后吸干水分，留取左心室及室間隔，自心尖到心室基底部將心肌橫切成厚2 mm左右的組織片，放入氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)的溶液(0.5 g/L)中，在37 ℃恒溫水浴中染色15 min后取出沖凈拭干，梗死區(qū)心肌未著色，非梗死區(qū)呈紫藍(lán)色，計算梗死區(qū)重量占整個左心室重量的百分?jǐn)?shù)，作為心肌梗死范圍的測定。

6 細(xì)胞凋亡率檢測 再灌注120 min麻醉經(jīng)頸動脈取血后，取出心臟，將缺血區(qū)心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧尿甘缺口末端標(biāo)記法，按照試劑盒說明進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)綠色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取5個高倍視野，計算出平均每100個細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)(%)表示凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

7 Western blot測 Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 取 -80 ℃深低溫保存的心肌組織約100 mg，加入1 ml細(xì)胞裂解液，勻漿破碎，4 ℃離心15 000 r/min 30 min取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)含量，制成含蛋白量相等的樣品。行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳。然后將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS中封閉，加入一抗，4 ℃封閉過夜；第二日，TBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下?lián)u床上孵育1 h；按Western blot發(fā)光試劑盒說明書顯影，用Bio Rad密度掃描儀進(jìn)行掃描，測定各蛋白的相對光密度值。

8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以表示，兩組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 溫陽通脈方對心肌梗死面積的影響 NBT染色法顯示3組大鼠均有梗死心肌，但WTF組較IR組以及WTF+BA組梗死心肌的重量以及梗死心肌重量占左心室重量的百分比明顯減少(見表1)。

2 溫陽通脈方對心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示3組均可見凋亡的陽性細(xì)胞，但WTF組較IR組以及WTF+BA組心肌凋亡細(xì)胞數(shù)量以及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)值明顯減少，3組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)值比較(見表1)，3組大鼠的TUNEL染色結(jié)果(見圖1)。

3 溫陽通脈方對PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑的影響WTF組較IR組及WTF+BA組P-Akt的表達(dá)明顯增加；WTF組較IR組及WTF+BA組總Akt的RD無明顯差別；WTF組較IR組及WTF+BA組的P-Akt的RD明顯增加。3組大鼠的Akt和p-Akt的表達(dá)情況(見圖2)，3組大鼠的p-Akt的表達(dá)比較及Akt和p-Akt的RD值比較(見表2)。

討 論

溫陽通脈方具有溫陽化痰活血的功效，經(jīng)多年年臨床實踐觀察驗證為治療冠心病不穩(wěn)定性心絞痛的有效方劑[6]。本實驗通過對心肌梗死范圍的測定發(fā)現(xiàn)，WTF組的心肌梗死面積明顯小于IR組及WTF+BA組，表明溫陽通脈方能夠減少大鼠心肌再灌注損傷模型的心肌梗死面積，具有心肌保護(hù)作用。有研究表明，氧化應(yīng)激、鈣超載、內(nèi)皮功能紊亂以及細(xì)胞凋亡等均參與了心肌缺血-再灌注損傷，細(xì)胞凋亡是再灌注損傷發(fā)病機制的一個重要環(huán)節(jié)[7-9]。本實驗使用TUNEL法發(fā)現(xiàn)WTF組的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低于對照組，表明溫陽通脈方在一定程度上可能減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

再灌注損傷搶救激酶途徑(reperfusion injury salvage kinase，RISK)的激活是缺血-再灌注損傷的主要保護(hù)機制之一。目前發(fā)現(xiàn)RISK途徑主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-Akt和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p42/p44extra-cellular signal-regulated kinases，ERK1/2)兩條通路。PI3K-Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞凋亡、存活，以及增殖等活動中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。近年來大量實驗證實，缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)對心肌的保護(hù)作用與PI3K-Akt的激活有關(guān)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡與壞死[10-13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，溫陽通脈方組P-Akt的蛋白表達(dá)較IR組及溫陽通脈方+阻滯劑組均明顯增加，證實了溫陽通脈方可能是通過激活PI3-Akt途徑，減少了心肌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到心肌保護(hù)作用。

綜上所述，溫陽通脈方具有心肌保護(hù)作用，能夠減少心肌細(xì)胞凋亡，其作用的機制可能與PI3K-Akt激酶途徑激活有關(guān)。大量實驗及臨床研究也表明中藥在改善血流動力學(xué)、保護(hù)血管內(nèi)皮功能、降低缺血再灌注損傷、改善心肌代謝等方面具有保護(hù)作用且多層次、多靶點調(diào)理內(nèi)環(huán)境，效果顯著[14-16]。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代實驗方法，研究溫陽通脈方對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其機制，對運用中藥防治冠心病，開發(fā)臨床減輕心肌缺血-再灌注損傷有效方劑，具有重要的科學(xué)意義及廣闊的應(yīng)用前景。

圖1 3組大鼠的TUNEL染色結(jié)果(×400)Fig.1 TUNEL staining of tissue from IR group(A), WTF group(B), and WTF+BA group (C) (×400)

圖2 IR組(A)，WTF組(B)，WTF+BA組(C)P-Akt，Akt的表達(dá)Fig.2 Expression of P-Akt and Akt in IR group (A), WTF group(B)and WTF+BA group(C)

表1 三組心肌梗死面積及細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比較Tab.1 Myocardial infarction size and AI in 3 groups

表2 三組p-Akt以及Akt和p-Akt的RD值比較Tab.2 RD for p-Akt, Akt and p-Akt in 3 groups

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