磷酸二酯酶抑制劑對糖尿病大鼠抗氧化作用的實驗研究

于海英，焦金菊

遼寧醫(yī)學院 生理學教研室，遼寧錦州 121000

糖尿病晚期患者多數(shù)伴有多器官并發(fā)癥，成為致死的主要因素。研究表明氧化應激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，臨床和實驗研究證實氧化應激及抗氧化能力減弱是糖尿病并發(fā)癥的主要病因[1]。應用抗氧化治療可逆轉(zhuǎn)氧化應激對組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase inhibitors，PDEIs)臨床主要用于治療呼吸道痙攣、舒張血管平滑肌、增強心肌收縮力等[2]。最近有報道稱PDEIs具有抗氧化作用[3]。本實驗應用米力農(nóng)，昔多芬，茶堿3種PDEIs治療由鏈脲佐菌素誘導的大鼠糖尿病模型，探討3種PDEIs對糖尿病大鼠氧化應激的影響及保護作用，為糖尿病及其并發(fā)癥的藥物治療提供新的思路。

材料和方法

1 實驗動物與試劑 健康成年SD(sprague dawley)雄性大鼠30只，體質(zhì)量180~220 g，遼寧醫(yī)學院動物中心提供。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)為Sigma公司產(chǎn)品；米力農(nóng)為山東新時代藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；茶堿為湖北武漢藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；昔多芬為嘉興宜博生物醫(yī)藥科技有限公司出品；丙二醛、總抗氧化能力檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。血糖檢測儀為美國強生公司onetouch。

2 糖尿病大鼠模型建立 將實驗大鼠適應性喂養(yǎng)1周，給予12 h -12 h光照-黑暗周期(6：00 ~18：00)。造模組腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg，(STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH值為4.4)，對照組腹腔注射等量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，36 h后由尾靜脈取血測空腹血糖，血糖＞16.7 mmol/L且穩(wěn)定即可確認糖尿病。造模過程中約有20%的死亡率，死亡的動物由新動物造模補充。

3 實驗分組 實驗分5組，即非糖尿病對照組(未注射STZ)，將已成模的糖尿病大鼠隨機再分成4組，每組6只：糖尿病對照組；PIDEs組分別為米力農(nóng)組給予米力農(nóng)3.17 mg/(kg·d)，茶堿組給予茶堿 100 mg/(kg·d)，昔多芬組給予昔多芬 1 mg/(kg·d)。兩個對照組給予相同量的0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)15 d灌胃給藥。15 d后所有大鼠先取血液樣本，然后被處死。

4 血糖、體重測定 大鼠在治療前及治療后5 d、10 d和15 d稱體重，并尾靜脈抽取靜脈血滴在試紙上，采用血糖儀(onetouch)自動讀取數(shù)值，記錄。

5 丙二醛檢測 將采集的血液樣本用肝素鈉抗凝，1 000 r/min離心10 min。收集上層血漿采用丙二醛(malondualdenyde，MDA)試劑盒進行檢測。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA與硫代巴比妥酸結(jié)合，形成紅色產(chǎn)物，測在532 nm處最大吸收峰值。

6 總抗氧化能力測定 TAOC測定采用TAOC試劑盒用鐵還原法進行測定[3]。

結(jié) 果

1 血糖、體重檢測 造模后大鼠活動減少，精神萎靡。非糖尿病對照組血漿葡萄糖(5.1~5.4) mmol/L，實驗大鼠經(jīng)STZ誘導后血糖可達(21.8±0.8) mmol/L，表明糖尿病大鼠模型制備成功。三種PDEIs治療組血糖水平與糖尿病對照組治療前后比較血糖水平無明顯變化(表1)，說明PDEIs對于血糖無影響。而從體重方面看，非糖尿病組體重隨時間推移逐漸增加，其他組動物體重隨著時間推移逐漸下降，各治療組動物體重下降情況與糖尿病模型組并無統(tǒng)計學差異(表1)，因而PDEIs也無調(diào)節(jié)體重作用。

2 體內(nèi)氧化應激水平 非糖尿病對照組大鼠的TAOC和MDA與糖尿病對照組大鼠比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表2)。三種磷酸二酯酶抑制劑都顯著降低了血漿MDA水平，同時提高了TAOC水平(P＜0.01)，且對于TAOC的水平提高能力為米力農(nóng)＞昔多芬＞茶堿，表2。

表1 各組動物體質(zhì)量，血糖值(n=6，

表1 各組動物體質(zhì)量，血糖值(n=6，

aP＜0.01，與NDM組比較，bP＜0.05

?

表2 血漿MDA, TAOC測量值(n=6，μmol/L)

表2 血漿MDA, TAOC測量值(n=6，μmol/L)

P＜0.01，與DM組比較

?

討 論

糖尿病發(fā)病機制復雜，主要表現(xiàn)為糖代謝紊亂，后期常常出現(xiàn)多個器官的并發(fā)癥而給患者帶來嚴重后果。目前糖尿病并發(fā)癥的致病原因中，體內(nèi)氧化應激水平升高是公認的損傷機制。一些報道認為抗氧化酶活性的減少導致了TAOC降低，如超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶[4]。臨床上抗氧化應激的藥物有多種，如天然抗氧化劑維生素C，E等，但是研究報道這些藥物并不能減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率[5]。以往PDEIs主要作為強心、血管舒張、平滑肌舒張、抗哮喘、抗抑郁等藥應用[6]。PDEIs的藥理作用主要是增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cydic adenosine monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平并促進組織釋放NO[7]。最近研究報道PDEIs有提高機體抗氧化的能力，本實驗分別選取米力農(nóng)(3型PDEIs)、茶堿(4型PDEIs)、昔多芬(5型PDEIs)治療糖尿病大鼠，在一定程度上降低了血漿MDA水平同時提高了總抗氧化能力。米力農(nóng)的抗氧化能力要比昔多芬和茶堿強，能顯著引起總抗氧化能力的提高并減少氧化應激。這表明PDEIs由于抗氧化應激效應而對糖尿病具有保護性作用。研究表明氧化應激引起的生物學反應與脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物有關(guān)，能誘發(fā)包括G蛋白、cAMP、cGMP、蛋白激酶C、MAP級聯(lián)等多種致病的細胞內(nèi)信號發(fā)生，最終導致細胞功能障礙[8]。而我們發(fā)現(xiàn)PDEIs在抗氧化應激方面發(fā)揮著重要作用，可以對抗并逆轉(zhuǎn)由STZ誘導的糖尿病大鼠血漿氧化應激水平。

實驗中發(fā)現(xiàn)PDEIs對于動物的血糖和體重無調(diào)節(jié)作用，這說明其對糖尿病大鼠的保護作用不是通過降低葡萄糖濃度實現(xiàn)的。Bhatia等[9]報道NO在血管內(nèi)皮細胞通過cGMP和cAMP協(xié)同作用發(fā)揮抗氧化作用。他們認為cAMP介導的NO保護內(nèi)皮細胞損傷的機制是通過cGMP依賴抑制cAMP分解實現(xiàn)的。此外還有報道NO能保護肺成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、人神經(jīng)母細胞瘤細胞和腮腺免受氧化應激引起的細胞損傷[10]。因此應用PDEIs增加了環(huán)化核苷酸能夠?qū)寡趸瘧ひ鸬募毎δ苷系K和細胞凋亡。關(guān)于cAMP和cGMP磷酸二酯酶保護作用的確切機制還需要進一步研究[11]。

1 Xu XJ， Gauthier MS， Hess DT， et al. Insulin sensitive and resistant obesity in humans： AMPK activity， oxidative stress， and depotspecific changes in gene expression in adipose tissue［J］. J Lipid Res， 2012， 53（4）：792-801.

2 Saha SS， Ghosh M. Antioxidant and anti-inflammatory effect of conjugated linolenic acid isomers against streptozotocin-induced diabetes［J］. Br J Nutr， 2012， 108（6）：974-983.

3 Iris F， Benzi F， Strain S. Ferric reducing antioxidant assay［J］.Methods Enzymol， 1999， 292（3）： 15-27.

4 Calabrese V， Cornelius C， Leso V， et al. Oxidative stress，glutathione status， sirtuin and cellular stress response in type 2 diabetes［J］. Biochim Biophys Acta， 2012， 1822（5）：729-736.

5 Clerici G， Slavescu C， Fiengo S， et al. Oxidative stress in pathological pregnancies［J］. J Obstet Gynaecol， 2012， 32（2）：124-127.

6 Roman-Ramos R， Almanza-Perez JC， Fortis-Barrera A， et al.Antioxidant and anti-inflammatory effects of a hypoglycemic fraction from Cucurbita ficifolia Bouché in streptozotocin-induced diabetes mice［J］. Am J Chin Med， 2012， 40（1）：97-110.

7 張榮媛，尚愛加，段秋華，等．大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時間血清SOD和MDA的變化［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2007，28（6）：428-429．

8 Piaz VD， Giovannoni MP. Phosphodiesterase 4 inhibitors， structurally unrelated to Rolipram， as promising agents for the treatment of asthma and other pathologies［J］. Eur J Med Chem， 2000， 35（5）： 463-480.

9 Bhatia S， Shukla R， Madhu SV， et al. Antioxidant status， lipid peroxidation and nitric oxide end products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy［J］. Clin Biochem， 2003， 36（7）：557-562.

10 Liani R， Halvorsen B， Sestili S， et al. Plasma levels of soluble CD36，platelet activation， inflammation， and oxidative stress are increased in type 2 diabetic patients［J］. Free Radic Biol Med， 2012， 52（8）：1318-1324.

11 Jahanshahi G， Motavasel V， Rezaie A， et al. Alterations in antioxidant power and levels of epidermal growth factor and nitric oxide in saliva of patients with inflammatory bowel diseases［J］. Dig Dis Sci， 2004， 49（11-12）：1752-1757.