單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液的制備工藝

羅 宏 鄒意瓊

（西南藥業(yè)股份有限公司 藥物研究所，中國(guó) 重慶400038）

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（monosialoganglioside，簡(jiǎn)稱GM1）在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)節(jié)苷脂含量豐富，其中以神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)含量最高。 GM1 是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組分，是唯一能透過(guò)血腦屏障的外源性神經(jīng)節(jié)苷脂制劑[1]。 GM1 能促進(jìn)各種原因所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能恢復(fù)，對(duì)損傷后繼發(fā)性神經(jīng)退化有預(yù)防作用[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明[3－4]，在腦損傷早期給予單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療，可提高平均動(dòng)脈壓，保護(hù)腦組織內(nèi)Ca2+－ATP 酶活性，起到穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，改善腦組織缺血缺氧，加強(qiáng)能量代謝，從而減輕腦水腫，阻斷繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展。另外，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉是一種神經(jīng)修復(fù)藥物，它可以清除自由基、保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，從而減輕帕金森?。≒arkinsin's Disease，PD）患者的癥狀[5]。 因此，臨床上GM1 主要用于治療急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及帕金森病。

GM1 由一個(gè)唾液酸，一個(gè)葡萄糖，二個(gè)半乳糖，一個(gè)氨基半乳糖及一個(gè)神經(jīng)酰胺殘基組成，具有水溶性和脂溶性，GM1 鈉鹽具有較好的水溶性。 且對(duì)熱穩(wěn)定性較好。 因此，將GM1 做成注射劑。 按照注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，性狀、可見異物、不溶性微粒、細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌、有關(guān)物質(zhì)和含量必須符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前，應(yīng)用臨床上的GM1 制劑主要是從豬腦中提取出來(lái)的，原料中除GM1 外，還有雜蛋白、GM2、GD3和其它雜質(zhì)等。 這些雜質(zhì)都會(huì)對(duì)GM1 注射劑質(zhì)量有影響。 因此，需要摸索GM1 注射劑的生產(chǎn)工藝， 使之盡量除去雜蛋白對(duì)注射劑澄清度的影響，同時(shí)減少有關(guān)物質(zhì)的量。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂雜質(zhì)對(duì)照品（由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液（以下簡(jiǎn)稱GM1 注射液，自制）；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉（湖南賽隆藥業(yè)有限公司）；氯化鈉（自貢鴻鶴藥業(yè)有限公司）；針用活性炭（上?；钚蕴繌S）；磷酸（重慶川東化工有限公司）；乙晴（成都金山化學(xué)試劑有限公司）和四氫呋喃（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）等。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（安揭倫科技公司）、pH 計(jì)（上海雷磁儀器廠）、紫外分光光度計(jì)（安揭倫科技公司）、不溶性微粒檢測(cè)儀（北京東方森聯(lián)自動(dòng)化技術(shù)有限公司）和澄明度檢測(cè)儀（天津大學(xué)精密儀器廠）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 GM1 注射液的制備

先加入配置總量80%的注射用水， 注射用水溫度控制在75-85℃，將氯化鈉等輔料溶解后，再加入單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉原料，,攪拌溶解。 最后加入活性炭，并保溫20 分鐘，待藥液冷卻后，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH，通過(guò)115℃滅菌30min 后，得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液。

2.2 GM1 含量測(cè)定

照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010 年版二部附錄VD）測(cè)定。

色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)： 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05mol/L 磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH 至3.5）-乙腈（15：85）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm；理論塔板數(shù)按單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉峰計(jì)算應(yīng)不低于500。

測(cè)定法： 精密移取單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液1mL 置于25mL 容量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液（濃度為0.4mg/mL）；另取工作對(duì)照品適量，精密稱定，用水定量稀釋成每1mL中約含0.4mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液，分別取供試品溶液和對(duì)照品各溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉的含量應(yīng)為標(biāo)示量的90.0-110.0%。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.3 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液制備工藝的考察

2.3.1 有關(guān)指標(biāo)

①藥液滅菌后pH 測(cè)定： 參照 《中國(guó)藥典》2010 版二部附錄ⅥH pH 測(cè)定法。 ②藥液可見異物檢查：按照《可見異物檢查細(xì)則和判斷標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 ③有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定：有關(guān)物質(zhì)用高效液相法測(cè)定，單雜應(yīng)不超過(guò)1.0%，總雜應(yīng)不超過(guò)5%。 ④GM1 含量測(cè)定：用高效液相法測(cè)定GM1 的含量，含量應(yīng)在90%～110%范圍內(nèi)。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4 高溫、光照試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，對(duì)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液工藝影響較大的幾個(gè)方面如藥液配制溫度、活性炭、滅菌溫度進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以篩選最佳處方，如表1。 結(jié)果見表2。

由表2 可知，對(duì)單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液含量的影響因素B〉C〉A(chǔ)，并得知最佳方案為A3B1C3。

2.3.3 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液質(zhì)量檢測(cè)：按照A3B1C3方案在公司小容量注射劑車間中試放大三批， 藥液經(jīng)過(guò)0.45μm 和0.22μm 兩級(jí)過(guò)濾，灌封后通過(guò)115℃滅菌30min，樣品經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果見表3。 并且檢驗(yàn)合格的第三批樣品放置在高溫（60±2）℃，相對(duì)濕度（75±5）% ；光照（4500±500）Lx 條件下10d，于第5、第10 天取樣檢測(cè)，結(jié)果見表4。 可見，用A3B1C3方案制備的注射液結(jié)果較好。

3 討論

3.1 GM1 是從豬腦中提取出的物質(zhì)，原料中除GM1 外，還有雜蛋白、GM2、GD3和其它雜質(zhì)等。 這些雜質(zhì)都會(huì)對(duì)注射劑質(zhì)量有影響。 因此必須在配制過(guò)程中保持一定溫度，使原料中的雜質(zhì)通過(guò)高溫變性，并且加適量活性炭將雜質(zhì)和變性后的雜蛋白除去， 同時(shí)要保證注射劑無(wú)菌，需要滅菌。

3.2 在配制過(guò)程中將藥液溫度控制在75-85℃，以除去雜蛋白。 GM1原料中有雜蛋白，雜蛋白如果控制不好，影響藥液的可見異物，根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)，選擇加熱使蛋白質(zhì)變性。 再通過(guò)加入活性炭吸附和過(guò)濾方式除去蛋白質(zhì)。

3.3 活性炭有吸附雜質(zhì)、 除去熱原等作用。 GM1 注射液中加入活性炭，將變性后的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)除去，保證藥液可見異物符合規(guī)定，同時(shí)降低有關(guān)物質(zhì)的量。 注射劑中活性炭常用量為0.01-0.5%。 但活性炭同時(shí)對(duì)GM1 有吸附作用。為保證主藥含量的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了不同濃度活性炭對(duì)主藥的吸附的考察，從試驗(yàn)結(jié)果表明，活性炭的用量為0.01%，既保證主藥含量，又能使藥液可見異物符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

3.4 滅菌溫度的確定：根據(jù)注射劑的要求，對(duì)熱穩(wěn)定的產(chǎn)品，其F0值必須大于8，最好采用過(guò)度殺滅法，按此要求，選擇不同的滅菌溫度試驗(yàn)，結(jié)果是采用過(guò)度殺滅法有關(guān)物質(zhì)中單雜明顯升高，且不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，而采用殘存概率法滅菌，其質(zhì)量均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，因此，滅菌溫度確定為115℃滅菌30 分鐘。

［1］姜靜巖，范雪亮，等.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療顱腦損傷的臨床觀察[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2012，22（2）：144-146.

［2］姜靜巖，劉順良，李慧，等.單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療急性顱腦損傷201 例[J].臨床醫(yī)藥，2011，20（7）：54-55.

［3］陳志剛，盧亦成，朱誠(chéng)，等.神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 在顱腦損傷早期的腦保護(hù)作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23（4）：420－422.

［4］Ledeen RW，Wu G.Nuclear lipids: key signaling effectors on the nervoussystem and other tissues [J].J Lipid Res，2004（45）：1－8.