基因組重排技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用

魏希穎 ，王家穩(wěn)，劉清梅，胡妍妍

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062）

微生物資源的開發(fā)利用是繼動(dòng)植物資源之后的第三大生物支柱產(chǎn)業(yè)，具有可再生性．其開發(fā)利用的基礎(chǔ)首先是選育新性狀、高產(chǎn)和低能耗等特性的優(yōu)良菌株，然而直接從自然界中篩選到的原始菌株往往不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，需經(jīng)過不同的育種方法進(jìn)行菌種改良以滿足生產(chǎn)所需．傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)雖然操作簡(jiǎn)便、技術(shù)成熟，但是存在許多不足之處，如盲目性高、工作量大、效率低等問題．運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對(duì)微生物進(jìn)行定向基因操作，雖然較傳統(tǒng)育種取得了一定成果，但是基因型和表型相應(yīng)背景的欠缺限制了其應(yīng)用．由此，研究開發(fā)高效定向的微生物菌種選育方法一直是微生物科學(xué)工作者們所面臨的重要課題．

基因組重排（Genome Shuffling）技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期，美國加州Maxgen公司Cardayré等［1］首次提出的，是基于DNA Shuffling的原理［2］，將傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)相結(jié)合，以整個(gè)基因組作為重組對(duì)象的多親本原生質(zhì)體遞推融合技術(shù)．該技術(shù)能大幅度提高微生物細(xì)胞的正向突變頻率及正向突變速度，使得人們能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得高效的正向突變的菌株，它是近年發(fā)展起來的微生物育種新技術(shù)，并被視為是菌株選育和代謝工程上的重大里程碑［3］．

1 基因組重排的建立及其優(yōu)勢(shì)

1．1 基因組重排的建立

從20世紀(jì)90年代開始，微生物育種學(xué)逐漸與代謝工程、化學(xué)工程和進(jìn)化工程相結(jié)合而發(fā)展起來．90年代初，美國加州Maxygen生物技術(shù)公司Cardayré等就萌發(fā)DNA重排和基因組重排育種的思路．Stemmer等［2］在1994年率先提出DNA重排技術(shù)，該技術(shù)是一種體外定向進(jìn)化分子的方法，在一定程度上模仿生物體自然進(jìn)化過程中減數(shù)分裂期等位基因間的DNA片段交換，首先用DNAaseI將同源的DNA消化成片段，再將得到的隨機(jī)片段無引物PCR，使之重新隨機(jī)裝配從而獲得多種排列組合的突變基因庫．

基于相似的原理，Crameri等［4］在1998年將DNA重排技術(shù)延伸到DNA家族重排上，它是以來自不同種屬的同源基因進(jìn)行DNA重排操作的技術(shù)．該技術(shù)打破不同種屬間的遺傳界限，通過提高親本基因群中差異的組合頻率和重排子代的雜合度，以增加突變文庫的多樣性，提高突變文庫的質(zhì)量，進(jìn)而有效地產(chǎn)生滿足需要的突變體．

由于生物體中的絕大部分表型受到多個(gè)基因協(xié)同調(diào)控，2002年，Zhang等［1］又進(jìn)一步提出在細(xì)胞水平的基因組重排，該技術(shù)模擬自然進(jìn)化的過程，將誘變育種技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)相結(jié)合，以分子進(jìn)化為核心在實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)微生物全細(xì)胞快速定向進(jìn)化．首先對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行人工誘變，選擇目標(biāo)性狀超過出發(fā)菌株的正突變體，構(gòu)成各種變異體組成的突變庫，然后將這些帶有不同有益基因的多親本菌株進(jìn)行多輪遞推式原生質(zhì)體融合，這樣通過有性生殖［5－6］或基因重組在全基因范圍內(nèi)交換重組遺傳信息來合理利用突變菌庫中的基因差異，消除并淘汰有害突變，高效地積累并綜合突變庫中所有親本大部分有益變異基因，從而達(dá)到跳躍性的人工進(jìn)化目標(biāo)，同時(shí)獲取表型最優(yōu)的后代．Stemmer等首次將基因組重排技術(shù)應(yīng)用于弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae），研究顯示僅通過兩輪遞推式融合所得到的高產(chǎn)菌株就能優(yōu)于歷經(jīng)20年經(jīng)過20輪常規(guī)誘變所獲得的高產(chǎn)菌株；之后Patnaik R等［7］應(yīng)用該技術(shù)提高了乳酸桿菌的耐酸能力和產(chǎn)量．由此可見，基因組重排可有效提高菌株間基因組的重組頻率，縮短選育周期，使獲得優(yōu)良突變株的頻率得到極大的提高．該技術(shù)不僅能改良工業(yè)菌株的生產(chǎn)特性，還能為各種各樣的微生物提供信息源和復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，被證實(shí)是一種具有廣闊應(yīng)用前景的新技術(shù)［8］．

1．2 基因組重排的優(yōu)勢(shì)

基因組重排的基礎(chǔ)是誘變技術(shù)與原生質(zhì)體融合技術(shù)，它是傳統(tǒng)育種技術(shù)的發(fā)展和延伸．作為一種新型、快速、有效的技術(shù)，其與經(jīng)典的誘變育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)．

1．2．1 避免菌株產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)” 傳統(tǒng)的育種技術(shù)連續(xù)的誘變會(huì)造成菌株產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，而基因組重排過只需經(jīng)過一次誘變，避免了菌種因長(zhǎng)期使用誘變劑而導(dǎo)致的自身抗性增強(qiáng)和產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”等現(xiàn)象．

1．2．2 快速、高效，省時(shí)，設(shè)備簡(jiǎn)單 傳統(tǒng)育種技術(shù)具有較大的盲目性、隨機(jī)性、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且菌株突變面臨回復(fù)現(xiàn)象等難題．若需得到具有單一基因正向突變的菌株，傳統(tǒng)育種技術(shù)至少需要105的變異文庫進(jìn)行篩選，而基因組重排只需經(jīng)過一次誘變獲取微量的正突變株后，通過連續(xù)多次的“遞推式原生質(zhì)體融合”，進(jìn)行多親本全基因組范圍內(nèi)交換重組遺傳信息，就能夠快速、高效地積累多親本全部正向突變特點(diǎn)的子代．該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，設(shè)備易得，費(fèi)用低廉，應(yīng)用前景廣闊．

1．2．3 多親本的基因水平轉(zhuǎn)移 傳統(tǒng)的誘變育種實(shí)質(zhì)上是單親的變異和遺傳，需要多次誘變和篩選的繁雜過程，花費(fèi)漫長(zhǎng)的周期，才能實(shí)現(xiàn)單一菌株上發(fā)生多點(diǎn)有利突變．基因組重排是一種多水平遺傳方式，它通過原生質(zhì)體的遞推式融合使基因組發(fā)生高效的重組，提高了親本遺傳的多樣性，使多重優(yōu)良性狀子代出現(xiàn)的頻率更高．同時(shí)，由于繼承了原生質(zhì)體融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，基因組重排可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源親本的基因水平轉(zhuǎn)移，為微生物育種提供更加廣闊的操作空間．如Zhao等［9］將不同種的輪梗霉和黑曲霉進(jìn)行融合篩選了高產(chǎn)花生四烯酸（AA）和具有利用廣譜碳源的菌株；John等［10］用德式乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii NCIM2025）和淀粉酶產(chǎn)生菌（Bacillus amyloliquefaciensATCC23842）進(jìn)行融合篩選出了高產(chǎn)L－乳酸的菌株．

1．2．4 子代菌株具有的遺傳多樣性 基因組重排源于誘變技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)，但三者最大區(qū)別在于基因組重排使用多親本、多正向突變菌株和遞推式融合，由于DNA重組的隨機(jī)性，能產(chǎn)生和積累各種各樣的正突變組合．因此經(jīng)重排后的子代菌株間的遺傳距離將高于兩親本間的遺傳距離，這將增加子代群體內(nèi)的遺傳多樣性，從而提高獲得優(yōu)良性狀菌株的概率，為進(jìn)一步改良菌株提供豐富的資源，同時(shí)也能為菌株復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控提供數(shù)據(jù)信息．如：El－Gendy等［11］利用RAPD技術(shù)對(duì)野生菌株、出發(fā)菌和融合菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明它們之間存在很大的差異；Xu等［12］利用AFLP技術(shù)對(duì)野生菌、出發(fā)菌和融合菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，同樣表明經(jīng)過誘變和重排后的菌株同野生菌相比存在很大的差異．

1．2．5 產(chǎn)生的子代穩(wěn)定性與安全性高 由于基因組重排是模擬自然進(jìn)化的過程，通過原生質(zhì)體融合將多親本不同的有益基因融合重組積累正突變基因，同時(shí)降低或消除了有害、中性突變．如Stephen B del Cardayré所說：“它原本就是在自然界中實(shí)實(shí)在在發(fā)生的事情，我們只是幫助這些菌株打破了它們之間的界限，加快了它們的遺傳物質(zhì)組合在一起的速度”［1］．因此該技術(shù)篩選出的菌株的穩(wěn)定性更高．相對(duì)基因工程菌株而言，該技術(shù)是利用生化手段讓親本中優(yōu)良的基因自然地集中在一起，不存在利用外來基因進(jìn)行拼接的可能，因此經(jīng)基因組重排產(chǎn)生的菌株的安全性亦更高．

1．2．6 無須對(duì)菌種遺傳背景十分清楚，有效地對(duì)由“多基因”調(diào)控的性狀進(jìn)行改良DNA重組技術(shù)、定向進(jìn)化工程、代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)手段等，使人們有可能直接得到理想中的優(yōu)良性狀，在一定程度上達(dá)到了定向進(jìn)化的目的，但這些技術(shù)手段都是建立在對(duì)目標(biāo)菌株遺傳背景深入了解的基礎(chǔ)上，需要花費(fèi)巨額的費(fèi)用和較長(zhǎng)的時(shí)間代價(jià)去探索其遺傳規(guī)律．基因組重排則無須了解微生物生命活動(dòng)的深層調(diào)控機(jī)制，它以細(xì)胞內(nèi)整套基因組為對(duì)象，可進(jìn)行隨機(jī)地交換重組整合，通過篩選最佳的“組合”，加快定向進(jìn)化的速率，對(duì)于“多基因”調(diào)控的性狀改良效果明顯，能夠達(dá)到快速育種的目的．

2 基因組重排的應(yīng)用

基因組重排充分結(jié)合傳統(tǒng)誘變育種和細(xì)胞工程的優(yōu)勢(shì)，具有快速高效改良工業(yè)菌種表型的能力［2，6］，還能為各種各樣的微生物提供信息源和復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)．目前，基因組重排主要應(yīng)用于提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)率，增強(qiáng)菌株對(duì)環(huán)境的耐受性，提高底物利用率和范圍，改變代謝途徑產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物等．

2．1 提高產(chǎn)物產(chǎn)率

經(jīng)過基因組重排后能夠有效的優(yōu)化和調(diào)節(jié)多基因控制的性狀來提高產(chǎn)量．Hida等［13］通過基因組重排，對(duì)鏈霉菌（Streptomyces sp．U121）采用NTG誘變，然后進(jìn)行3輪原生質(zhì)體遞推融合后篩選到一高產(chǎn)菌株3－61，其產(chǎn)羥甲基檸檬酸的產(chǎn)量比野生菌株提高5倍；El－Gendy等［11］對(duì)諾卡氏菌（Nocardia sp．ALAA 2000）采用EMS和UV進(jìn)行誘變，經(jīng)過3輪重排后篩選到一株高產(chǎn)綾霉素的融合菌F3／22，其產(chǎn)量比野生菌提高了19倍；Zhang等［14］采用基因組重排對(duì)謝曼（氏）丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）進(jìn)行改造，使其產(chǎn)維生素B12的能力比出發(fā)菌株提高61%；Gong等［15］通過基因組重排對(duì)纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）進(jìn)行改造，使抗癌新藥埃博霉素B（epothilone B）的產(chǎn)量比野生菌提高了130倍．

2．2 增強(qiáng)菌株對(duì)環(huán)境的耐受性

目前，基因組重排已經(jīng)成功應(yīng)用于提高菌株對(duì)酸、鹽、底物、溫度、產(chǎn)物等因素的耐受性．如通過基因組重排提高菌株對(duì)酸的耐受性［7，15，16－17］；啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐乙醇和高產(chǎn)乙醇能力［5，6］；Cao等［18－19］分別對(duì)魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和假絲酵母（Candida versatilis）進(jìn)行基因組重排篩選出具有耐鹽和廣譜pH的融合菌株；Xu等［12］用基因組重排獲得了具有提高產(chǎn)普納霉素的始旋鏈霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）對(duì)普納霉素的耐受性；Shi等采用基因組重排獲取的融合子可以在55℃下正常生長(zhǎng)和能耐受25%（V／V）的乙醇［20］．

2．3 提高底物利用率和范圍

基因組重排同樣適用于提高菌株對(duì)底物的利用能力和范圍．Burkhard［21］等應(yīng)用基因組重排篩選到一株更高效利用甘油的菌株，使其產(chǎn)物1，3－丙二醇產(chǎn)量相較原始菌提高80%；Dai等［22］利用基因組重排對(duì)Sphingobium chlorophenolicum ATCC39723表型改良，經(jīng)過3輪基因組重排后，篩選的融合菌比野生菌對(duì)五氯苯酚具有更高利用率；Zhao等［9］利用基因組重排對(duì)輪梗霉和黑曲霉進(jìn)行3輪重排，篩選到一株能利用8種碳源和6種氮源的融合菌；Kang等［23］經(jīng)過3輪遞推融合篩選到一株高效利用淀粉水解液達(dá)97．9%的融合菌株．

2．4 改造微生物的代謝途徑產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物

應(yīng)用基因組重排還可以改變菌株的代謝途徑產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物．Cao等［18］利用基因組重排對(duì)魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）進(jìn)行3輪重排后篩選到一株能高產(chǎn)香味化合物和新化合物 的融合菌株；Wang等［24］對(duì)一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌（Tuberculariasp．TF5）用UV和NTG對(duì)原生質(zhì)體誘變建立突變庫，經(jīng)過1輪重排，篩選到一株突變株（M－741）能產(chǎn)生3種新的倍半萜類（Sesquiterpenoids）化合物，另一株重排融合菌（G－444）能產(chǎn)生新的18種其他化合物，其中有10種化合物是在TF5中沒有檢測(cè)到的物質(zhì)．

3 基因組重排應(yīng)用存在的問題與展望

3．1 存在問題

基因組重排在應(yīng)用過程中存在的問題：（1）首先在選擇遺傳變異足夠豐富的突變體進(jìn)行原生質(zhì)體遞推融合時(shí)，正突變基因組文庫的篩選和篩選模型的建立存在一定困難；（2）在遞推融合過程中原生質(zhì)體的形成率、再生率、活性及其融合菌株高效、高通量篩選模型的建立限制了基因組重排的廣泛應(yīng)用；（3）基因組重排應(yīng)用菌種改良過程中，由于基因組片段重組也是隨機(jī)的并不具備定向性，在積累有益突變時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些中性和有害突變體，有時(shí)甚至喪失固有的優(yōu)良性狀，如何高效、定向的篩選目的表型融合菌存在著一定的困難和挑戰(zhàn)；（4）基因組重排目前普遍運(yùn)用于同種單親本菌株，對(duì)于不同種多親本細(xì)胞之間的報(bào)道還是很少，且存在同源性越差，重組頻率越低的問題；（5）雖然基因組重排可以快速、高效的改進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)菌種或優(yōu)化代謝途徑，但是僅僅通過基因組重排人們很難了解發(fā)生改進(jìn)或優(yōu)化的原因及分子機(jī)制．

3．2 展望

基因組重排利用原有基因進(jìn)行交換重組，這是在傳統(tǒng)育種、原生質(zhì)體融合以及DNA重排的基礎(chǔ)上對(duì)微生物育種技術(shù)的一次革命性的改進(jìn)，隨著基因組重排的不斷成熟，各種普適的高通量、高效快速篩選策略的出現(xiàn)必將促進(jìn)基因組重排的廣泛應(yīng)用，選育出更加適合工業(yè)生產(chǎn)的菌種；同時(shí)隨著生物信息學(xué)、代謝工程、基因工程、功能基因組學(xué)等其他生物技術(shù)與之相結(jié)合，必將揭示基因型和表型的關(guān)系以及代謝途徑得到優(yōu)化的分子機(jī)制，甚至發(fā)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)中一些未知的調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)該技術(shù)還有可能成為以后新型化合物開發(fā)中的一個(gè)有力工具．特別是在目前的研究發(fā)展中，基因組重排被廣泛應(yīng)用于提高許多新型藥用微生物的產(chǎn)量，以滿足人們對(duì)藥物的需求，同時(shí)也解決了眾多藥物資源缺乏的困境．該技術(shù)在今后的藥物微生物菌種選育和其他工業(yè)微生物育種研究過程中將得到進(jìn)一步的應(yīng)用和發(fā)展．

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