布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)研究進展

董 浩，吳清民

（中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物流行病和人畜共患病重點實驗室，北京100193）

二元調(diào)控系統(tǒng)是一種可以對環(huán)境信號進行感應(yīng)、傳遞并做出相應(yīng)適應(yīng)的調(diào)控機制。典型的二元調(diào)控系統(tǒng)通常是由與細胞膜結(jié)合的組氨酸激酶（histidine kinases，HK）和含有天冬氨酸殘基的反應(yīng)蛋白（response regulator，RR）組成，通過磷酸化的方式完成信號的傳遞。該信號傳遞過程由3個依次進行的3個酶促磷酰基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)組成：①組氨酸激酶與三磷酸腺苷（ATP）中的磷?；鶊F結(jié)合，使組氨酸激酶磷酸化（自磷酸化）；②組氨酸激酶將磷?；鶊F傳遞給反應(yīng)蛋白的天冬氨酸殘基，使反應(yīng)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變（轉(zhuǎn)移磷酸化）；③磷酸化的反應(yīng)蛋白與水反應(yīng)失去磷?；鶊F（去磷酸化）。在真核生物中，只有酵母和擬南芥中發(fā)現(xiàn)過少量二元調(diào)控系統(tǒng)，而在原核生物的基因組中平均有約1%的基因編碼不同的二元調(diào)控系統(tǒng)。在細菌中，二元調(diào)控系統(tǒng)不僅參與感應(yīng)pH、養(yǎng)分、滲透壓、抗生素、氧化還原狀態(tài)等環(huán)境信號，還控制著對細菌生長、毒力、生物膜、趨化性、趨光性和群體感應(yīng)等有重要作用的基因簇［1］。對細菌二元調(diào)控系統(tǒng)的研究，在揭示細菌與周圍環(huán)境之間的相互作用、細菌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及病原菌的致病機制與防治等多個方面都有重要意義。本文綜述了布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀及二元調(diào)控系統(tǒng)在布魯菌病防控中的應(yīng)用。

1 布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)

布魯菌是一種革蘭陰性的胞內(nèi)寄生菌。由布魯菌感染引起的布魯菌?。ú疾。┦且环N嚴重的人獸共患病，給養(yǎng)殖業(yè)、人類健康和動物源性食品安全帶來很大的威脅。布病在世界各地都廣泛流行，據(jù)報道有123個國家和地區(qū)發(fā)生過該病，主要分布在亞洲、非洲和中南美洲。目前世界上除了少數(shù)幾個發(fā)達國家宣布根除了布魯菌病外，大多數(shù)國家都存在該?。?］，每年全世界因布病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元。

與其他的病原菌相比，布魯菌不具有經(jīng)典的毒力因子。其致病機制主要是布魯菌具有在各種宿主細胞，如吞噬細胞內(nèi)極強的生存和增殖能力。布魯菌被吞噬細胞吞噬后，需要應(yīng)對酸性pH、缺氧、活性氧介質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）、活性氮介質(zhì)（reactive nitrogen species，RNS）、營養(yǎng)匱乏等多種不利環(huán)境［3］。迅速地感應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境信號并且做出反應(yīng)對于布魯菌在巨噬細胞內(nèi)的生存是至關(guān)重要的。布魯菌基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在布魯菌中存在21個基因假定編碼的二元調(diào)控系統(tǒng)［4］，目前在布魯菌中研究比較清楚的二元調(diào)控系統(tǒng)共有7組。

1.1 BvrR／BvrS二元調(diào)控系統(tǒng)

Sola－Landa A等［5］通過轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)篩選到毒力降低的bvrR和bvrS 2個基因的突變株，且這2個突變株對聚合陽離子和表面活性劑敏感性增強。通過同源性比對發(fā)現(xiàn)BvrR／BvrS與根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的 ChvI／ChvG 及 苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的ChvI－ExoS二元調(diào)控系統(tǒng)具有極高的同源性（87%～89%和70%～80%）。在牛布魯菌中，bvrR和bvrS基因缺失后在小鼠體內(nèi)的毒力顯著降低，在HeLa細胞和鼠源巨噬細胞內(nèi)的侵入能力也是顯著降低，且無法在胞內(nèi)繁殖。

BvrR／BvrS缺失株中外膜蛋白 Omp25和Omp22在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均顯著降低［6］，并且類脂A的酰基化程度和疏水性都發(fā)生了改變［7］。然而，在Omp22缺失株和Omp25缺失株中天然半抗原多糖成分，LPS和外膜蛋白的表達水平，對于補體殺傷和多黏菌素B的敏感性，以及在細胞模型和動物模型中的生存能力均與野生菌株無顯著差異［8］，說明外膜蛋白表達水平的差異并不是BvrR／BvrS二元調(diào)控系統(tǒng)被破壞后毒力降低的主要原因。

隨著轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學的發(fā)展，極大地推動了基因功能方面的研究。Viadas C等［9］通過基因芯片的方法對bvrR缺失株進行轉(zhuǎn)錄組分析時發(fā)現(xiàn)，與野生株相比bvrR缺失株有127個基因差異表達（83個基因表達上調(diào)，44個基因表達下調(diào)）；編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶操縱子和麥芽糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的操縱子表達水平下調(diào)；多個與細菌外膜成分，應(yīng)激反應(yīng)，代謝相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子差異表達。Martinez－Nunez C等［10］發(fā)現(xiàn)BvrR蛋白可以直接結(jié)合到virB操縱子的啟動子序列上，且影響著群體感應(yīng)系統(tǒng)vjbR基因的表達。這些研究充分闡明了BvrR／BvrS二元調(diào)控系統(tǒng)與細菌毒力之間的關(guān)聯(lián)。值得注意的是這種二元調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)細菌分泌系統(tǒng)表達的機制在根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、巴爾通體（Bartonella henselae）等其他α－變形菌中普遍存在，說明這種保守的調(diào)節(jié)模式在這些細菌與宿主相互作用過程中發(fā)揮著重要的作用［10］。

1.2 OtpR二元調(diào)控系統(tǒng)

羊種布魯菌的otpR基因的編碼產(chǎn)物具有二元調(diào)控系統(tǒng)的高度保守的結(jié)構(gòu)域，它與下游基因cpk（cAMP依賴的蛋白激酶調(diào)控亞單位）共同構(gòu)成了一個操縱子。OtpR與新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）中的CenR蛋白有較高的同源性（indentity：65%，similarity：79%）。otpR基因是通過轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)篩選布魯菌毒力相關(guān)基因時發(fā)現(xiàn)其突變株在細胞和小鼠模型中均致弱［11］。進一步研究表明，otpR缺失株在高溫、高滲和低pH環(huán)境中生存能力顯著降低［12］，除此之外otpR基因還對維持細菌的正常細胞形態(tài)以及耐受β－內(nèi)酰胺類抗生素起到關(guān)鍵作用［13］。然而，OtpR作為一個調(diào)節(jié)蛋白不具有接受信號分子的功能區(qū)，其對應(yīng)的感應(yīng)蛋白目前仍是未知的。

1.3 LOV－組氨酸激酶

LOV功能區(qū)在新月柄桿菌（Caulobacter cres－centus）、枯草芽胞桿菌（Bacillis subtilis）和丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）等細菌中與光信號的感應(yīng)相關(guān)。在布魯菌基因組中，有一個含有LOV功能區(qū)的組氨酸激酶（LOV－HK），光照可以增強這個激酶的活性，這說明這個激酶很可能與細菌感應(yīng)光信號密切相關(guān)。Swartz T E等發(fā)現(xiàn)布魯菌在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)時，其在細胞模型和小鼠模型中的毒力低于見光培養(yǎng)的布魯菌。而當牛種布魯菌中編碼LOV－組氨酸激酶的基因缺失后，無論缺失株在光照還是黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，其在J774A.1巨噬細胞中生存和增殖能力均顯著降低，且和黑暗中培養(yǎng)布魯菌的毒力類似。這充分闡明了LOV組氨酸激酶在介導光照與布魯菌毒力的關(guān)聯(lián)中發(fā)揮著重要的作用。由于布魯菌的生活史與其宿主緊密聯(lián)系，所以布魯菌是何時感應(yīng)光信號就難以解釋。一種可能是當布魯菌隨著被感染的胎盤一起排出體外時，暴露在光源下，LOV－組氨酸激酶調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達以準備對新宿主的感染［14］。

1.4 NtrY／NtrX二元調(diào)控系統(tǒng)

NtrY／NtrX二元調(diào)控系統(tǒng)在α－變形菌中廣泛存在，ntrY基因的同在田菁莖瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）及莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus）中與細菌的氮代謝以及生物固氮相關(guān)［15－17］。Foulongne V等［19］通過轉(zhuǎn)座子突變了豬布魯菌的ntrY基因，發(fā)現(xiàn)該基因的突變株在人類巨噬細胞中無法生存［18］。Carrica M C等發(fā)現(xiàn)NtrY蛋白是以血紅素為輔因子，可與NO和CO形成復合物，且在存在氧氣的情況下極易被氧化為三價鐵的穩(wěn)定狀態(tài)，由此解釋了NtrY組氨酸激酶感應(yīng)環(huán)境中氧化水平的機制。細菌雙雜交技術(shù)驗證了在布魯菌中NtrY與其下游的NtrX相互作用，即NtrY／NtrX二元調(diào)控系統(tǒng)在布魯菌中也是保守的。進一步的研究表明，ntrY基因缺失后在正常條件下和微氧條件下都影響了反硝化途徑中4個操縱子的表達水平，這說明NtrY／X二元調(diào)控系統(tǒng)很可能與布魯菌在微氧條件下生存是相關(guān)的。

1.5 FeuP／FeuQ二元調(diào)控系統(tǒng)

FeuP／FeuQ是布魯菌中第一個被發(fā)現(xiàn)的二元調(diào)控系統(tǒng)，它與豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）中調(diào)控鐵攝取的二元調(diào)控系統(tǒng)FeuP／FeuQ同源性高達96%。豬布魯菌的feuP基因缺失后在動物模型和細胞模型中均不致弱，而且在缺鐵環(huán)境中的生存能力和野生株也沒有顯著差異［20］。然而Lestrate P等［21］卻發(fā)現(xiàn)在羊布魯菌中feuQ突變株在動物模型和細胞模型中均致弱，這種差異很可能是由于細菌生物型的不同而引起的。

1.6 NtrB／NtrC二元調(diào)控系統(tǒng)

Dorrell N等［22］通過同源性比對發(fā)現(xiàn)在布魯菌存在一個與NtrC轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族同源性高達90%的基因。NtrC與感應(yīng)蛋白NtrB組成一個二元調(diào)控系統(tǒng)NtrB／NtrC。在其他多種細菌中，NtrB／NtrC二元調(diào)控系統(tǒng)與細菌的氮代謝以及毒力相關(guān)。豬種布魯菌的ntrC基因缺失株在不同溫度條件下生長速度沒有差別，然而當存在多種氨基酸時，缺失株的代謝活性降低。與親本菌株相比，ntrC基因缺失株在巨噬細胞內(nèi)的生存和增殖能力沒有差別，但是在小鼠感染過程中ntrC基因缺失株在小鼠脾臟內(nèi)增殖的速度要低于親本菌株。

1.7 PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)

PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)是由含有N端鈉離子／溶質(zhì)共轉(zhuǎn)運功能區(qū)的組氨酸激酶（PrlS）和屬于LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（PrlR）組成。在體外環(huán)境中，PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)缺失的菌株無法在高滲環(huán)境中出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。進一步的試驗表明這個二元調(diào)控系統(tǒng)感應(yīng)的信號與離子強度相關(guān)，而且PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)的缺失株在小鼠模型中生存能力顯著降低［23］。

2 二元調(diào)控系統(tǒng)在布魯菌病防控中的應(yīng)用

由于編碼組氨酸激酶（HK）和反應(yīng)蛋白（RR）的基因只存在于原核生物以及少數(shù)低等真核生物的基因組中，這使得病原菌的二元調(diào)控系統(tǒng)成為一個理想的抗菌藥物靶點。此外，和傳統(tǒng)的抗菌藥物不同，二元調(diào)控系統(tǒng)抑制物阻斷了二元調(diào)控系統(tǒng)對毒力因子的調(diào)控從而降低病原菌的毒力，而并非殺死病原菌，極大地降低了細菌耐藥性的產(chǎn)生［24］。目前，在致病性大腸埃希菌，結(jié)核分支桿菌及根癌農(nóng)桿菌等細菌中已經(jīng)鑒定出多種二元調(diào)控系統(tǒng)的抑制物［25－26］。盡管現(xiàn)在尚無布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)抑制物方面的報道，但是這種方法可以很好的解決傳統(tǒng)布病治療過程中長期服用抗生素易產(chǎn)生耐藥性的缺陷，因此在治療人布魯菌病方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，雖然已有S19、RB51和Rev.1等多個布魯菌疫苗株，但其安全性和免疫保護力仍無法令人滿意，因此尋找更安全更有效布魯菌疫苗的研究從未停止。鑒于bvrR／bvrS缺失株具有毒力弱，光滑型LPS表型，且在常規(guī)細菌培養(yǎng)基中生長良好等特性，人們嘗試著使用bvrR／bvrS缺失株去開發(fā)新型布魯菌病疫苗。用bvrR／bvrS缺失株免疫小鼠后用牛種布魯菌2308攻毒，所產(chǎn)生的免疫保護力與S19一致，并且效果優(yōu)于RB51。更重要的是在bvrR／bvrS缺失株中不產(chǎn)生Omp3b蛋白，可以用于血清學鑒別。由于基因缺失疫苗菌株需要在宿主體內(nèi)存活足夠長的時間才能建立起持久有效的免疫力，在這方面bvrR／bvrS缺失株還是存在不足。將bvrS缺失株與粗糙型wbkA缺失株共同接種Balb／c小鼠可以顯著地延長細菌在小鼠體內(nèi)的存在時間，而且在使用牛種布魯菌攻毒時能產(chǎn)生比S19更好的免疫保護力［27］。除了bvrR／bvrS缺失株，研究者們也嘗試使用otpR缺失株開發(fā)新型布魯菌疫苗，然而和bvrR／bvrS缺失株類似，由于otpR缺失株在動物模型中很快即被清除，因此無法建立起有效的免疫保護力（資料未發(fā)表）。

3 展望

目前，布魯菌中還有多個二元調(diào)控系統(tǒng)未被研究過，鑒于布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)對于細菌抵御宿主的各種防御機制至關(guān)重要，布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)的深入研究對于揭示布魯菌的致病機制將起到重要的作用。除此之外，由于人類細胞主要采用絲氨酸／蘇氨酸和酪氨酸激酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白活性，在哺乳動物細胞中也不存在組氨酸激酶，這使得通過阻斷布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)實現(xiàn)控制布魯菌感染成為一種理論上安全且有效的方法。因此，尋找布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)的抑制物無疑對抗布魯菌感染具有重大的意義。

［1］ 郝艷華，張 維，陳 明.細菌雙組分系統(tǒng)的研究進展［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2012，14（2）：67－72.

［2］ 賁百靈，孫廣力，婁永利.布魯氏菌病流行現(xiàn)狀和防治建議［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2005（7）：38－39.

［3］ Kohler S，F(xiàn)oulongne V，Ouahrani－Bettache S，et al.The analysis of the intramacrophagic virulome of Brucella suis deciphers the environment encountered by the pathogen inside the macrophage host cell［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（24）：15711－15716.

［4］ DelVecchio V G，Kapatral V，Redkar R J，et al.The genome sequence of the facultative intracellular pathogen Brucella melitensis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（1）：443－448.

［5］ Sola－Landa A，Pizarro－Cerda J，Grillo M J，et al.A two－component regulatory system playing a critical role in plant pathogens endosymbionts is present in Brucella abortus and controls cell invasion and virulence［J］.Mol Microbiol，1998，9（1）：125－138.

［6］ Guzman－Verri C，Manterola L，Sola－Landa A，et al.The twocomponent system BvrR／BvrS essential for Brucella abortus virulence regulates the expression of outer membrane proteins with counterparts in members of the Rhizobiaceae［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（19）：12375－12380.

［7］ Manterola L，Moriyón I，Moreno E，et al.The lipopolysaccharide of Brucella abortus BvrS／BvrR mutants contains lipid A modifications and has higher affinity for bactericidal cationic peptides［J］.J Bacteriol，2005，187（16）：5631－5639.

［8］ Manterola L，Guzman－Verri C，Chaves－Olarte E，et al.BvrR／BvrS－controlled outer membrane proteins Omp3aand Omp3b are not essential for Brucella abortus virulence［J］.Infect Immun，2007，75（10）：4867－4874.

［9］ Viadas C，Rodriguez M C，Sangari F J，et al.Transcriptome analysis of the Brucella abortus BvrR／BvrS two－component regulatory system［J］.PLoS One，2010，5（4）：e10216.

［10］ Martinez－Nunez C，Altamirano－Silva P，Alvarado－Guillen F，et al.The two－component system BvrR／BvrS regulates the expression of the type IV secretion system VirB in Brucella abortus［J］.J Bacteriol，2010，192（21）：5603－5608.

［11］ Wu Q，Pei J，Turse C，et al.Mariner mutagenesis of Brucella melitensis reveals genes with previously uncharacterized roles in virulence and survival［J］.BMC Microbiol，2006，6：102.

［12］ Zhang X，Ren J，Li N，et al.Disruption of the BMEI0066gene attenuates the virulence of Brucella melitensis and decreases its stress tolerance［J］.Int J Biol Sci，2009，5（6）：570－577.

［13］ Liu W，Dong H，Liu W，et al.OtpR regulated the growth，cell morphology of B.melitensis and tolerance toβ－lactam agents［J］.Vet Microbiol，2012，159（1－2）：90－98.

［14］ Swartz T E，Tseng T S，F(xiàn)rederickson M A，et al.Blue－lightactivated histidine kinases：two－component sensors in bacteria［J］.Science，2007，317（5841）：1090－1093.

［15］ Foulongne V，Bourg G，Cazevieille C，et al.Identification of Brucella suis genes affecting intracellular survival in an in vitro human macrophage infection model by signature tagged transposon mutagenesis［J］.Infect Immun，2000，68（3）：1297－1303.

［16］ Ishida M L，Assumpcao M C，Machado H B，et al.Identification and characterization of the two－component NtrY／NtrX regulatory system in Azospirillum brasilense［J］.Braz J Med Biol Res，2002，35（6）：651－661.

［17］ Gregor J，Zeller T，Balzer A，et al.Bacterial regulatory networks include direct contact of response regulator proteins：interaction of RegA and NtrX in Rhodobacter capsulatus［J］.J Mol Microbiol Biotechnol，2007，13（1－3）：126－139.

［18］ Pawlowski K，Klosse U，de Bruijn F J.Characterization of a novel Azorhizobium caulinodans ORS571two－component regulatory system，NtrY／NtrX，involved in nitrogen fixation and metabolism［J］.Mol Gen Genet，1991，231（1）：124－138.

［19］ Carrica M C，F(xiàn)ernandez I，Marti M，et al.The NtrY／X twocomponent system of Brucellaspp.acts as a redox sensor and regulates the expression of nitrogen respiration enzymes［J］.Mol Microbiol，2012，85（1）：39－50.

［20］ Dorrell N，Spencer S，F(xiàn)oulonge V，et al.Identification，cloning and initial characterisation of FeuPQ in Brucella suis：a new sub－family of two－component regulatory systems［J］.FEMS Microbiol Lett，1998，162（1）：143－150.

［21］ Lestrate P，Dricot A，Delrue R M，et al.Attenuated signaturetagged mutagenesis mutants of Brucella melitensis identified during the acute phase of infection in mice［J］.Infect Immun，2003，71（12）：7053－7060.

［22］ Dorrell N，Guigue－Talet P，Spencer S，et al.Investigation into the role of the response regulator NtrC in the metabolism and virulence of Brucella suis［J］.Microb Pathog，1999，27（1）：1－11.

［23］ Mirabella A，Yan?ez Villanueva R M，Delrue R M，et al.The two－component system PrlS／PrlR of Brucella melitensis is required for persistence in mice and appears to respond to ionic strength［J］.Microbiology，2012，158（Pt10）：2642－2651.

［24］ Utsumi R，Igarashi M.Two－component signal transduction as attractive drug targets in pathogenic bacteria［J］.Yakugaku Zasshi，2012，132（1）：51－58.

［25］ Santos E V，Silva G，Cardozo G P，et al.In silico characterization of three two－component systems of Ehrlichia canis and evaluation of a natural plant－derived inhibitor［J］.Genet Mol Res，2012，11（4）：3576－3584.

［26］ Zhou P，Long Q，Zhou Y，et al.Mycobacterium tuberculosis two－component systems and implications in novel vaccines and drugs［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2012，22（1）：37－52.

［27］ Grillo M J，Manterola L，deMiguel M J，et al.Increases of efficacy as vaccine against Brucella abortus infection in mice by simultaneous inoculation with avirulent smooth bvrS／bvrR and rough wbkA mutants［J］.Vaccine，2006，15（24）：2910－2916.