自體組織重建膀胱可用于膀胱成形術(shù)患者

Atala A 著 鄧震 譯

外傷可導(dǎo)致膀胱的損傷甚至摘除，部分先天異常的兒童，如膀胱外翻、脊髓脊膜膨出或者尿道瓣膜發(fā)育延遲患兒，會出現(xiàn)高壓、高滲、低順應(yīng)性膀胱。這些患者在藥物治療無效后常需要膀胱成形術(shù)，因此器官修復(fù)或移植勢在必行。

胃腸道常常作為膀胱成形術(shù)中的供體組織。但是，當(dāng)這種組織被植入泌尿系統(tǒng)，多種并發(fā)癥也會隨之而來，許多研究者又陸續(xù)采用了不同的方式、材料及組織，移植或修復(fù)膀胱。其中許多游離組織以及一些合成材料，尤其是使用游離腸組織，但由于力學(xué)、結(jié)構(gòu)、功能或者生物相容性的問題，這些嘗試都失敗了。永久性合成材料破壞了力學(xué)結(jié)構(gòu)、易發(fā)尿路結(jié)石，可降解材料易導(dǎo)致成纖維細(xì)胞沉積、瘢痕形成、移植物攣縮，隨著時(shí)間的延長，膀胱容量減少。很明顯，由于膀胱組織的彈性特性和泌尿道上皮通透性，其很難輕易被替換、移植。所以，用于功能重建的自體泌尿組織數(shù)量有限。因此，美國威克森林大學(xué)溫斯頓塞勒姆醫(yī)學(xué)院小組負(fù)責(zé)人Alan B Retik等把經(jīng)過篩選的細(xì)胞植入人工組織重建的膀胱內(nèi)，為膀胱再造探索出另一種方法——自體膀胱組織重建。

Alan B Retik等共收入7例患者（3男，4女，平均年齡11歲，年齡跨度4～19歲）。這些患者都患有先天性疾病——脊柱裂。

試驗(yàn)前，首先將7例患者分為3組：A組：3例患者對其膀胱直接去細(xì)胞，并從粘膜下層提取膠原用來接種自體健康細(xì)胞；B組：1例患者接受的是將用大網(wǎng)膜包裹的膠質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的人工膀胱；C組：3例患者植入的是經(jīng)大網(wǎng)膜包裹的PGA膠原所做的復(fù)合材質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)的人工膀胱。另有2例患者（一位采用膠原培養(yǎng)方法，一位復(fù)合材質(zhì)培養(yǎng)方法）失訪。針對每一例入組對象，移植前進(jìn)行尿流動力學(xué)檢查、膀胱造影、泌尿生殖器B超、血清、尿常規(guī)及尿培養(yǎng)檢查。最后3例患者采用3D CT影像評估盆腔的年齡分期及尺寸，大小、形狀及容量，以及手術(shù)前的膀胱狀態(tài)。測定分析后，以獲得理想膀胱的平均尺寸，進(jìn)一步制造理想容量的復(fù)合材質(zhì)膀胱。

膀胱成形術(shù)前7～8周，患者經(jīng)膀胱鏡取本體及組織工程膀胱活組織評估6～8次。組織工程膀胱標(biāo)本取自穹窿部的后壁、前外側(cè)壁以及膀胱頸附近的三角區(qū)周圍取活檢標(biāo)本（1～2 cm2）。尿路上皮及肌層細(xì)胞用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)。早期傳代細(xì)胞置于小玻璃罐內(nèi)，放于液氮箱內(nèi)凍存。移植前完整檢測細(xì)胞及培養(yǎng)液的污染情況。

另外，Alan B Retik等為試驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩種支架，第一種支架是用直接去細(xì)胞的膀胱粘膜下基質(zhì)制作而成，用于前4例患者，即A、B組患者。另一種支架用可生物降解的復(fù)合物膠原及PGA構(gòu)成，用于后3例即C組患者進(jìn)行膀胱塑形。支架的總厚度大約是2.0 mm，初始尺寸范圍在70～150 cm2。所有的支架都用環(huán)氧乙烷先消毒，再用紫外線進(jìn)一步消毒。

一切準(zhǔn)備就緒后，開始構(gòu)建人工膀胱：每一種細(xì)胞共培養(yǎng)70個(gè)培養(yǎng)皿（直徑150 mm），每個(gè)培養(yǎng)皿大約有10×106個(gè)細(xì)胞，用于組建一個(gè)組織工程膀胱。

從膀胱活檢到組織工程膀胱移植大約需7～8周。術(shù)前患者口服抗生素一周。麻醉成功后，從劍突下1到2指到做一縱形切口至恥骨上。膀胱用十字切口暴露。放置兩根導(dǎo)尿管，一根置于恥骨上，另一根置于尿道內(nèi)。細(xì)胞學(xué)支架與自體膀胱使用4-0號縫線縫合，支架外部注入纖維蛋白膠。將硅膠引流置于腹膜后。3個(gè)移植入膠原支架的患者未用大網(wǎng)膜覆蓋。一個(gè)植入膠原支架，另外三個(gè)植入復(fù)合物支架的患者均使用大網(wǎng)膜充分覆蓋。

與常規(guī)的腸膀胱成形術(shù)不同，患者術(shù)后不需要長期的胃腸減壓，最快可以在術(shù)后1d正常飲食。另外，兩根導(dǎo)尿管都在術(shù)后持續(xù)開放，在沒有引流物后的3～5 d后拔管。術(shù)后3周，行膀胱造影檢查，其中一根導(dǎo)尿管拔除，膀胱功能逐漸恢復(fù)。通過全天間歇性的夾閉、放開導(dǎo)尿管幫助膀胱功能恢復(fù)。

隨后進(jìn)行一系列的血清肌酐、電解質(zhì)及動脈血?dú)夥治?、腎臟B超、排泄性膀胱造影以及排尿動力學(xué)檢查、膀胱造影及B超、膀胱活檢以及血液分析，比較各種重建的人工膀胱功能及術(shù)后患者綜合情況。

術(shù)后隨訪時(shí)間跨度22～61個(gè)月（平均46個(gè)月），研究者發(fā)現(xiàn)：所有患者住院天數(shù)在23～34 d之間，平均28.5 d，僅1例患者繼發(fā)真菌感染，已妥當(dāng)處理，無其他術(shù)后并發(fā)癥出現(xiàn)。

術(shù)后3周，植入人工膀胱的患者進(jìn)行了導(dǎo)尿管的移除及間歇性導(dǎo)尿術(shù)，并按照常規(guī)的膀胱成形術(shù)處理方法，接受了抗膽堿酯酶藥物治療，行膀胱造影術(shù)未見膀胱滲漏。

術(shù)前所有患者的尿動力學(xué)功能均不佳。通過分析術(shù)后尿動力學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，移植人工膀胱的患者，直到隨訪的第61個(gè)月才開始出現(xiàn)收縮性、容量及順應(yīng)性的下降?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)術(shù)后效果最好的是應(yīng)用大網(wǎng)膜充分包裹的復(fù)合材料膀胱，膀胱容量壓力平均閾值下降，而體積、順應(yīng)性增加。而所有的患者在術(shù)后腸功能很快就恢復(fù)了。無不良代謝記錄，無泌尿系結(jié)石，分泌液正常，腎功能得到保護(hù)。

而且術(shù)后進(jìn)一步行膀胱檢查，幾乎看不出復(fù)合材料人工膀胱與本體膀胱的接合縫隙。所有的全層穿刺活檢顯示一個(gè)三層結(jié)構(gòu)，正如試驗(yàn)者預(yù)期的膀胱組織：包括了尿路上皮細(xì)胞襯里、粘膜下層和肌肉細(xì)胞。免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了人工膀胱活檢其組織結(jié)構(gòu)及表型理想。

作者通過將自體膀胱上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞分離，在體外擴(kuò)增，并將它們種植到到可生物降解的三維基質(zhì)上，為膀胱疾病終末期患者設(shè)計(jì)人工膀胱組織。

這項(xiàng)研究的目標(biāo)是降低膀胱內(nèi)的壓力，并提高膀胱的順應(yīng)性和可控性，從而提高病變膀胱的功能性。隨著時(shí)間的推移，膀胱順應(yīng)性不良的患者可能會產(chǎn)生腎功能損害，因此，避免任何進(jìn)展性腎臟疾病也是本研究的一個(gè)目標(biāo)。此外，利用胃腸道行擴(kuò)大術(shù)，往往會導(dǎo)致代謝異常，如酸中毒或堿中毒，另外結(jié)石形成的發(fā)生率增加，粘液分泌增加，最終增加了惡性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究目的是避免任何代謝異常，減少泌尿系結(jié)石形成的發(fā)生率，避免腸道黏液的產(chǎn)生。該人工膀胱，可在活檢獲得被植入膀胱細(xì)胞后7～8周內(nèi)植入。

使用復(fù)合支架材料與人工組織制成的膀胱重建能夠表現(xiàn)出良好的功能。后續(xù)尿動力學(xué)研究表明，膀胱順應(yīng)性及功能均有所提高。這些與移植了胃腸道組織重建膀胱術(shù)后的尿動力學(xué)改變相似，但是副反應(yīng)較后者卻明顯減少。在實(shí)驗(yàn)中腎功能得到了保護(hù)，所有患者的閉尿控制能力得到了明顯改善。通過組織學(xué)和免疫組化分析，人工膀胱段的組織活檢表現(xiàn)出理想的構(gòu)造和表型。

人工組織或器官供臨床使用的主要挑戰(zhàn)是開發(fā)可生物降解的三維結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)必須能容納足夠數(shù)量的細(xì)胞，從而形成功能組織。這種支架材料應(yīng)具有相應(yīng)的生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)特性，使得長期保存后可以保持組織的完整性。使用由PGA構(gòu)成的復(fù)合支架，被證明是最佳的人工膀胱組織。因?yàn)檫@種支架結(jié)構(gòu)的完整，膠原蛋白可支持細(xì)胞生長和存活。人工組織和器官的另一個(gè)挑戰(zhàn)：需要支持和維護(hù)足夠的血管供給移植的細(xì)胞。理想的結(jié)構(gòu)應(yīng)該能提供足夠的營養(yǎng)和氧氣，增強(qiáng)新生血管的形成。大網(wǎng)膜，常用于重建手術(shù)，因?yàn)樗転槠ぐ旰鸵浦参锾峁┴S富的血液供應(yīng)，最終在膀胱植入時(shí)選其作為包裹，并被證明是重要的和成功的。

所有患者因?yàn)榧顾柙錾惓＃瑢?dǎo)致排尿由異常神經(jīng)支配，所以術(shù)前均進(jìn)行間歇性導(dǎo)尿術(shù)。當(dāng)此類患者進(jìn)行膀胱成形術(shù)時(shí)，必須進(jìn)行間歇性導(dǎo)尿，為膀胱充分引流。因此用胃腸道行膀胱成形術(shù)患者必須間歇性導(dǎo)尿。雖然有研究表明，在狗植入人工膀胱后，神經(jīng)再支配恢復(fù)，可以導(dǎo)致正常排空。因此推斷動物在該術(shù)后，可以逐漸恢復(fù)正常的神經(jīng)支配，膀胱可以正常收縮排尿。通過這些研究結(jié)果，可以預(yù)計(jì)，如果患者有一個(gè)正常的神經(jīng)支配膀胱，術(shù)前可以自發(fā)排空，那么術(shù)后當(dāng)然也是一樣。當(dāng)然這一假設(shè)仍有待臨床試驗(yàn)。

作者表明，組織工程技術(shù)可以用來制造膀胱，這種膀胱可以被植入在需要膀胱成形術(shù)的患者體內(nèi)。植入的復(fù)合材料人工膀胱表現(xiàn)出優(yōu)越的功能參數(shù)，這樣的優(yōu)越性可以持續(xù)數(shù)年之久。雖然隨訪時(shí)間超過5年，但要將這種方法普及，仍需要更多的研究。