肝細(xì)胞生長因子對(duì)人羊水干細(xì)胞遷移和黏附能力的影響

焦志勇 羅敏 李盛 趙家峰 寧雪蓮

人羊水干細(xì)胞（human amniotic fluid stem cell，hAFSC）是一類具有胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）增殖分化特性的細(xì)胞，通過羊水穿刺獲取，具有比ESC易獲取、較強(qiáng)復(fù)制增殖能力和分化能力、可避免倫理問題等諸多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1-3]。肝細(xì)胞生長因子（heparoocyte growth factor，HGF），又稱擴(kuò)散因子（scatter factor，SF），是骨髓微環(huán)境分泌的主要細(xì)胞因子之一。國內(nèi)外研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone-marrow mesenchymal stem cell，BMSC）能表達(dá)HGF受體c-Met，HGF對(duì)MSC具有很強(qiáng)的趨化作用[4-5]。而HGF對(duì)于羊水干細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究在體外成功分離培養(yǎng)及鑒定羊水干細(xì)胞，并觀察HGF對(duì)羊水干細(xì)胞遷移黏附的影響。

材料和方法

一、材料

低 糖 DMEM（美 國 Hyclone公 司），胎 牛血清（以色列 Bioind公司），0.05﹪胰蛋白酶EDTA（美 國 Invitrogen 公 司），兔 抗 人 Oct-4、c-kit、SSEA-1、CD105抗體（英國 Abcam 公司），rhodamine及FITC標(biāo)記小鼠源二抗（Proteinch Group公司），HGF因子（美國BD公司），微孔隔離小室（Transwell）24孔板（美國 Corning costar公司）。

二、方法

1.hAFSC的培養(yǎng)：20例羊水標(biāo)本均采自18～24周孕婦，并在采集前均獲得孕婦本人的知情同意。本研究獲得南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。孕婦在B超定位后常規(guī)消毒，穿刺抽取羊水約20ml。1300 rpm離心10min，棄上清后保留0.5ml羊水，重懸細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入低糖DEME培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含100 U/ml青霉素及鏈霉素、10 ng/ml表皮生長因子、18﹪的胎牛血清。37 ℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，換液，以后1周換液2次。當(dāng)細(xì)胞融合80﹪時(shí)，0.25﹪胰蛋白酶EDTA消化，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1:3的比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次。hAFSC傳至第3代，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞免疫熒光鑒定hAFSC：第3代的hAFSC生長至80﹪融合時(shí)，0.25﹪胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種于蓋玻片，多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，5﹪山羊血清4 ℃封閉10min，分別加小鼠抗人Oct-4、兔抗人SSEA-4一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗細(xì)胞3次，加FITC標(biāo)記小鼠源二抗和rhodamine標(biāo)記兔源二抗，孵育30min，PBS洗3次后，封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.Western blot鑒定hAFSC：收集第3代的hAFSC，加入PAI裂解細(xì)胞，離心，取適量蛋白上清，加入適量5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水加熱變性，冰上冷卻。10﹪SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，確定分子量大小。5﹪脫脂牛奶封閉過夜，與兔抗人 Oct-4（1:750）、c-kit、SSEA-4、CD-105（1:1000）、兔抗人 vWF 及多克隆兔抗人β-actin抗體（1:2000）孵育后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:4000），室溫孵育2h，TBST洗膜3次，熒光試劑盒進(jìn)行發(fā)光，曝光于X光片，順序顯影、定影。

4.Transwell小室檢測(cè)hAFSC遷移能力：收集第3代的hAFSC計(jì)數(shù)后分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。將含有1×107個(gè)/L hAFSC的200μl培養(yǎng)液（α-MEM，0.5﹪ BSA）注入Transwell上室，將終濃度40 ng/ml hGF的1200μl趨化緩沖液注入實(shí)驗(yàn)組下室，注入1200μl趨化緩沖液至對(duì)照組下室，培養(yǎng)24 h，刮除濾膜上室面未移動(dòng)細(xì)胞，95﹪酒精固定，蘇木素染色，隨機(jī)選擇3個(gè)視野，200倍熒光顯微鏡下單盲計(jì)數(shù)下室的細(xì)胞數(shù)目，每組預(yù)設(shè)3次實(shí)驗(yàn)。

5.明膠貼壁法檢測(cè)hAFSC黏附能力：收集第3代的hAFSC，0.25﹪胰蛋白酶EDTA消化貼壁細(xì)胞，洗滌離心，含0.5﹪ BSA的α-MEM培養(yǎng)液重浮hAFSC，計(jì)數(shù)后分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，將1×107個(gè)/L細(xì)胞懸液200μl接種到明膠包被的24孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液中加入HGF至終濃度為40 ng/ml，37 ℃孵育30min，PBS洗滌3次，移除未貼壁細(xì)胞，200倍熒光顯微鏡下單盲計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，每個(gè)孔隨機(jī)選擇3個(gè)不同區(qū)域的貼壁細(xì)胞，求其平均數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組平均遷移細(xì)胞及黏附細(xì)胞數(shù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、hAFSC的免疫熒光鑒定

待細(xì)胞長至80﹪融合時(shí)，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，免疫熒光顯微鏡鑒定hAFSC特異性標(biāo)記物 Oct-4、SSEA-4（圖 1）。

二、westernblot鑒定hAFSC標(biāo)志物

Oct-4、c-kit、SSEA-4、CD105 在 hAFSC 表面均有表達(dá)，而HUVEC無表達(dá)，相反vWF為內(nèi)皮細(xì)胞的特征標(biāo)志物在HUVEC上高表達(dá)，而hAFSC不表達(dá)。表明實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為典型的hAFSC。（圖2）

三、HGF促進(jìn)hAFSC的遷移

采用Transwell小室分析細(xì)胞遷移力。實(shí)驗(yàn)組Transwell下室加有HGF，可見大量的hAFSC遷移至下室，平均每個(gè)視野的遷移細(xì)胞為 (80±3.2)細(xì)胞 /每視野（圖 3a），對(duì)照組平均每個(gè)視野遷移細(xì)胞數(shù)為(38±2.5)細(xì)胞/每視野（圖3b）。兩組相比結(jié)果具有顯著差異（P < 0.01，圖 3c）。

圖1 熒光倒置顯微鏡下觀察羊水干細(xì)胞的免疫熒光鑒定(×10)

圖2 westernblot檢測(cè)hAFSC

圖3 200倍熒光顯微鏡下觀察HGF促進(jìn) hAFSC遷移并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)（蘇木素染色×20）

圖4 200倍熒光顯微鏡下觀察HGF促進(jìn)hAFSC黏附并計(jì)數(shù)黏附貼壁細(xì)胞（×20）

四、HGF促進(jìn)hAFSC黏附

明膠貼壁法測(cè)定HGF對(duì)hAFSC細(xì)胞黏附能力影響。HGF組與對(duì)照組每個(gè)視野黏附細(xì)胞數(shù)分別為 (50±2.7)細(xì)胞 /每視野和(19±1.5)細(xì)胞/每視野。與對(duì)照組相比，HGF實(shí)驗(yàn)組黏附在明膠上的hAFSC明顯增多（圖4a），存活數(shù)比對(duì)照組增多近1倍（圖4b），兩者之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01，圖 4c）。

討 論

羊水干細(xì)胞是近年來備受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，細(xì)胞表型類似于胚胎于細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，干細(xì)胞因子c-kit、周期特異性胚胎抗原SSEA-4等胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記，說明羊水中含有比間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育更原始、增殖和分化能力更強(qiáng)、更接近于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞[1-3]。本研究利用貼壁法分離培養(yǎng)羊水干細(xì)胞，細(xì)胞熒光法及westblot法鑒定證明所分離培養(yǎng)的hAFSC表達(dá)Oct-4、c-kit、SSEA-4等特征標(biāo)志物，與文獻(xiàn)報(bào)道的羊水干細(xì)胞一致。

HGF是一種主要生長因子，又稱擴(kuò)散因子（scatter factor,SF），是骨髓微環(huán)境分泌的主要細(xì)胞因子之一，HGF與其受體c-Met蛋白結(jié)合，可激活受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶PTK，使受體自身磷酸化，同時(shí)使胞漿信使蛋白質(zhì)磷酸化，啟動(dòng)數(shù)條信號(hào)通路包括MAPK級(jí)聯(lián)、JNK通路、p38MAPK通路、PI3K-Akt通路、STAT通路和IKBa-NF-KB復(fù)合體等，從而調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖、遷移、黏附等[4-6]。

HGF對(duì)在體內(nèi)外對(duì)MSC具有很強(qiáng)的促趨化，黏附作用。Forte等[6]研究發(fā)現(xiàn)HGF可促進(jìn)MSCs的增殖和遷移，其促增殖作用需要p38的參與，促遷移作用則須通過PI3K信號(hào)通路。劉紅軍及鄭彥文等研究，均發(fā)現(xiàn)HGF能夠趨化BMSC的定向遷移，PI3K信號(hào)通路參與介導(dǎo)這一過程[7-8]。黃盛東等[9]研究發(fā)現(xiàn)在最適濃度下，HGF能顯著提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與纖維連接蛋白涂層的黏附，促進(jìn)干細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。

目前HGF對(duì)于羊水干細(xì)胞的遷移黏附的影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)初步分離培養(yǎng)并鑒定了hAFSC，并采用Transwell小室法和明膠貼壁法初步研究了HGF對(duì)于羊水干細(xì)胞遷移黏附的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明HGF對(duì)羊水干細(xì)胞遷移有很強(qiáng)的趨化作用，與對(duì)照組對(duì)比，遷移能力提高一倍多。HGF還明顯提高羊水干細(xì)胞的黏附能力，黏附能力提高也近一倍。

HGF對(duì)增強(qiáng)羊水干細(xì)胞的遷移黏附能力的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。Forte等[6]研究發(fā)現(xiàn)HGF可促進(jìn)MSC的增殖和遷移，其促增殖作用需要p38的參與，促遷移作用則須通過PI3K信號(hào)通路。Roval等[10]研究證實(shí)HGF通過與c-Met受體結(jié)合，引起受體二聚體發(fā)生構(gòu)象改變，激活PI3K信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)RAC1和P21激酶，引起細(xì)胞骨架重組及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和黏附能力。因此猜測(cè)HGF促進(jìn)羊水干細(xì)胞遷移黏附也是同樣機(jī)制，此假設(shè)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

HGF增強(qiáng)羊水干細(xì)胞的遷移和黏附，在羊水干細(xì)胞移植治療肝硬化方面具有重要的意義。肝硬化發(fā)生過程中，肝臟損傷部位局部高分泌的HGF可以趨化移植的羊水干細(xì)胞“停留”在損傷肝組織局部，有利于羊水干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化；而且國外研究證實(shí)HGF能抗MSC凋亡[6]，同時(shí)MSCs通過分泌HGF能抑制肝細(xì)胞的凋亡和壞死[11-12]，因此在羊水干細(xì)胞移植治療肝硬化時(shí)，HGF可使羊水干細(xì)胞的移植存活率升高，進(jìn)而提高治療效果。

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