慢病毒載體系統(tǒng)介導hUC-MSC綠色熒光蛋白和熒光素酶共表達技術(shù)體系的建立

林鳳錦 王水良 黃粱滸 王瑾 祝玲 王慶華 譚建明

間充質(zhì)干細胞是一類具有高度自我更新、增殖和多向分化潛能的干細胞。相對于骨髓源間充質(zhì)干細胞，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)具有增殖活性及成骨分化能力高，且來源廣泛、培養(yǎng)簡單、不易污染及提取無創(chuàng)傷等諸多優(yōu)點[1]。hUCMSC移植為臨床各系統(tǒng)疾病的損傷修復治療和細胞替代治療提供一種新的手段[2]，從而成為近年來醫(yī)學研究的熱點。

干細胞移植治療疾病的研究常需要在體外對將要移植的細胞進行標記，使這些細胞植入后，以及在體內(nèi)分化后仍能夠攜帶標記，研究人員借此可以對植入細胞的活動進行監(jiān)測，判斷其存活狀態(tài)。標記和示蹤方法有多種，早期使用較多的有生物染料DiI等[3-4]，還有利用干細胞不斷自我復制增殖的特性，使其在復制過程中攝取一些放射性標記的堿基或堿基的類似物，例如5溴-2脫氧尿苷(BrdU)，再用放射性核素顯影或者特異抗體檢測的方法[5]。

本研究通過慢病毒載體系統(tǒng)介導，成功地在hUC-MSC中引入外源綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和熒光素酶基因的共表達，且該雙外源蛋白的共表達對hUC-MSC的生長增殖無顯著影響。慢病毒載體系統(tǒng)介導hUCMSC綠熒光蛋白和熒光素酶共表達技術(shù)體系的建立不僅極大地方便了其體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的示蹤，同時也為基因工程修飾干細胞提供了強有力的手段。

材料和方法

一、材料

1.細胞和質(zhì)粒：hUC-MSC來源于福州總醫(yī)院泌尿外科實驗室干細胞組，取P4代細胞。人胚腎上皮細胞系HEK293T購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。慢病毒表達載體pLEXMCS購自美國Open Biosystem公司，慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G購自Addgene公司，GFP和熒光素酶共表達慢病毒載體pLEX-GFP-Luc由美國杜克大學李博士（Dr.Chuan-Yuan Li）惠贈。

2.酶和試劑：PCR試劑盒購自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成(序列見表1)；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、低糖DMEM購自美國Hyclone公司；Polybrene和聚乙烯亞胺（PEI）購自Sigama公司；嘌呤霉素購自ACROS公司；MTS、PMS和熒光素酶底物Luciferin購自 Promega公司 ；TRIzol購自 Life technolgies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN公司；SYBR和質(zhì)粒大提試劑盒購自ROCHE公司。

表1 RT-PCR擴增引物序列、擴增片段及退火溫度

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：人胚腎上皮細胞系HEK293T的培養(yǎng)使用含10﹪胎牛血清的DMEM/F12；hUC-MSC的培養(yǎng)使用含10﹪ 胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于含5﹪ CO2飽和濕度的37℃溫箱中。

2.慢病毒的包裝：正常培養(yǎng)的HEK293T細胞傳入100 mm培養(yǎng)皿后，待細胞長至80﹪左右匯合度時，以聚乙烯亞胺（PEI）為介導，將pLEX-GFP-Luc（或空載體pLEXMCS）連同兩個包裝質(zhì)粒psPAX2 和pMD2.G行共轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染12h后吸去轉(zhuǎn)染液，換正常培養(yǎng)基并置回溫箱培養(yǎng)，每隔24 h后收集含慢病毒的培養(yǎng)液，經(jīng)過濾（0.45 μmol/L濾器）后分裝，-80℃保存待用。

3.慢病毒的感染：正常培養(yǎng)的P4代hUC-MSC接種至100 mm培養(yǎng)皿，待細胞長至80﹪匯合度時吸去培養(yǎng)基，將適量病毒稀釋入含Polybrene(終濃度8 μg/ml)的常規(guī)培養(yǎng)基后加至培養(yǎng)皿中。感染24 h后，棄去感染液，換含嘌呤霉素（終濃度1 μg/ml）的新鮮培養(yǎng)基篩選24 h。

4.熒光顯微鏡及IVIS Kinetic成像系統(tǒng)觀察：慢病毒感染24 h并經(jīng)嘌呤霉素進一步篩選24 h后的P4代hUC-MSC置熒光倒置顯微鏡下直接觀察GFP的表達情況；同時，胰酶消化一部分細胞，1000 rpm離心5min后去上清，200μl無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后，再與 200μl的 Luciferin（300 μg/ml）充分混勻，置IVIS Kinetic成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄熒光素酶的表達情況。

5.細胞生長曲線作圖：慢病毒感染24 h并經(jīng)嘌呤霉素進一步篩選24 h后的P4代hUC-MSC接種至24孔板（3000個細胞/孔），從接種后24 h開始，連續(xù)7 d每天取樣，行MTS法測定活細胞數(shù)并繪制細胞生長曲線。

6.RT-PCR：依TRIzol法抽提培養(yǎng)細胞的總RNA，取各樣本2 μg總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以β-actin為內(nèi)參，行常規(guī)及實時定量RT-PCR法分析Cyclin D1、Cyclin E1和p21基因mRNA在對照和GFP和熒光素酶共表達慢病毒感染后的hUC-MSC中的表達情況。各基因RT-PCR擴增引物及PCR退火溫度見表1，常規(guī)PCR 擴增體系含 ：2.5μl 10×buffer、上下游引物各 100 pmol、1.5μl dNTP(2.5mmol/L each)、Taq酶 1.25 U、cDNA 1μl，ddH2O 補足至 25μl。PCR反應條件，94℃預變性3min，94℃變性30 s，特定溫度退火30 s，72℃延伸30 s的條件下循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像儀成像。實時定量RT-PCR 反應體系為 ：10μl 2×SYBR 混合物、上下游引物各 100 pmol、cDNA 1μl，ddH2O 補足至20μl；PCR 循環(huán)條件同上，反應于ABI 7900HT Fast PCR儀上完成。基因表達的相對定量方法為：以β-actin基因mRNA的表達為內(nèi)對照，首先依據(jù)公式ΔCt=Ct靶基因-Ctβ-actin，分別計算實驗組和對照組的ΔCt，再依公式ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組計算出ΔΔCt值，最后計算相對表達量的差值即 2-ΔΔCt。

三、統(tǒng)計學分析方法

細胞生長曲線作圖實驗各重復三次，統(tǒng)計學處理采用成對兩樣本等方差t檢驗計算單尾P值；實時定量RT-PCR實驗重復3次，每次做3個重復孔，取各次實驗的為最后結(jié)果，并以t檢驗行差異顯著性分析。以P < 0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、慢病毒感染不會造成體外培養(yǎng)hUCMSC形態(tài)的明顯改變

慢病毒感染并經(jīng)嘌呤霉素篩選后并未引致體外培養(yǎng)的hUC-MSC大量死亡，說明慢病毒包裝成功，且感染效率高。普通光學顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與未經(jīng)感染的正常培養(yǎng)細胞相比，慢病毒感染并不會造成體外培養(yǎng)的hUC-MSC形態(tài)的明顯改變（圖 1）。

二、慢病毒載體系統(tǒng)介導的GFP和熒光素酶在hUC-MSC中的共表達

熒光顯微鏡和IVIS Kinetic成像系統(tǒng)的觀察結(jié)果分別證實，GFP和熒光素酶經(jīng)慢病毒載體系統(tǒng)的介導可在hUC-MSC中成功地共表達（圖2，3）。

三、外源GFP和熒光素酶共表達對體外培養(yǎng)hUC-MSC生長增殖等表型無顯著影響

體外培養(yǎng)的P4代hUC-MSC經(jīng)對照或GFP和熒光素酶共表達慢病毒感染后，細胞生長曲線作圖結(jié)果表明二者的細胞生長增殖速率并無顯著差異（表2，圖4）。進一步的普通和實時定量RT-PCR法檢測結(jié)果也顯示，與對照慢病毒感染相比，GFP和熒光素酶共表達慢病毒感染后其細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E1 和p21WAF1/CIP1mRNA表達水平分別是對照組的1.11倍（P=0.130）、0.54倍（P=0.000002）和0.78倍（P=0.0052）。依實時定量RT-PCR結(jié)果的判定標準，通常認為相對表達倍數(shù)> 2或< 0.25為差異有統(tǒng)計學意義，據(jù)此認為GFP和熒光素酶共表達對細胞調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E1 和p21WAF1/CIP1mRNA表達水平無顯著影響，表明外源GFP和熒光素酶的共表達對體外培養(yǎng)的hUCMSC生長增殖等表型無顯著影響（表3，圖5）。

圖1 普通光學顯微鏡下觀察未經(jīng)感染、對照病毒感染和GFP及熒光素酶共表達病毒感染的hUC-MSC的形態(tài)

圖2 熒光顯微鏡觀察對照病毒感染和GFP及熒光素酶共表達病毒感染的hUC-MSC中GFP的表達情況

表2 對照病毒和GFP及熒光素酶共表達病毒感染hUC-MSC生長增殖結(jié)果

表3 hUC-MSC細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白mRNA表達水平的實時定量RT-PCR結(jié)果

圖3 IVIS Kinetic 成像系統(tǒng)觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSC）對照病毒感染和GFP及熒光素酶共表達病毒感染的hUC-MSC中熒光素酶的表達情況

圖4 對照病毒和GFP及熒光素酶共表達病毒感染hUC-MSC生長曲線

討 論

近年來，干細胞生物學的飛速發(fā)展在豐富了干細胞基礎(chǔ)理論的同時，也極大地促進了干細胞分離、體外培養(yǎng)和基因工程修飾等相關(guān)技術(shù)的持續(xù)改進；相應地，干細胞臨床應用的相關(guān)研究也蓬勃興起。迄今，基于其多向分化潛能，干細胞替代療法已在神經(jīng)退行性疾病以及腎臟等疾病的治療中得以廣泛應用[6]。此外，眾多研究均表明，干細胞尚可通過抑制多種免疫細胞如樹突狀細胞、T和B淋巴細胞以及自然殺傷細胞等的增殖和功能而在體內(nèi)發(fā)揮獨特的免疫調(diào)節(jié)作用[7-9]，這一屬性使其因在免疫調(diào)節(jié)紊亂性疾病中的巨大潛在治療價值而備受研究人員的關(guān)注。事實上，基于干細胞的治療已在移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種人類免疫性疾病的治療中得以成功應用[10]；在一項臨床試驗中也證實，自體間充質(zhì)干細胞輸注可顯著降低腎移植患者的急行排斥發(fā)生率，并有助于移植腎功能的及早恢復[11]。

圖5 hUC-MSC細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白mRNA表達水平的RT-PCR結(jié)果

干細胞有胚胎干細胞、成體干細胞和誘導性多潛能干細胞之分，目前臨床基礎(chǔ)和試驗研究中以屬成體干細胞的間充質(zhì)干細胞居多。間充質(zhì)干細胞依其來源分，主要包括骨髓間充質(zhì)干細胞和臍帶間充質(zhì)干細胞等。相比較而言，骨髓間充質(zhì)干細胞的基礎(chǔ)和臨床應用研究的開展較早，但鑒于其在骨髓內(nèi)含量有限，僅約占有核細胞的0.001﹪～0.01﹪，且骨髓MSC的數(shù)量和分化能力隨著年齡的增長相對減少和減弱[12]，這在很大程度上限制了其臨床應用；此外，骨髓MSC伴供者年歲增長而來的遺傳改變（如基因突變等）和表觀遺傳學的改變（特別是有害改變的蓄積）也進一步增加了其臨床治療應用中的潛在風險。在探索間充質(zhì)干細胞新來源的努力中，Romanov等[13]于2003年成功地從人臍帶中分離得到來源更為豐富、且細胞增殖活性和成骨分化能力更高的hUC-MSC，這無疑為干細胞治療的基礎(chǔ)和臨床應用研究開辟了一片全新的領(lǐng)地。

眾所周知，為有效地對植入體內(nèi)的干細胞活動進行監(jiān)測，判斷其存活狀態(tài)和轉(zhuǎn)歸，對輸注的干細胞進行體外標記以便示蹤勢在必行。早期使用比較多的標記和示蹤方法有生物染料法和放射性核素顯影法等[4-6]；但以上兩種方法都有自身局限性，生物染料可能在移植入的細胞死亡后漏出，再被周圍宿主細胞攝取從而形成假相；基于BrdU的放射性核素顯影法的缺陷在于植入的細胞無論是否存活，都可以被檢測到[14]。報告基因法以外源報告基因的成功表達和相應的活體檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，是近年發(fā)展起來并迅速得以優(yōu)化并廣為應用的新細胞標記和示蹤技術(shù)體系。傳統(tǒng)的報告基因法一般在擬標記失蹤的細胞內(nèi)引入單一的外源GFP或熒光素酶的表達，但鑒于二者各自的優(yōu)缺點，如熒光素酶表達的體外和活體檢測需額外底物，但其體內(nèi)失蹤信號較GFP表達的活體檢測時更為特異；而GFP的表達則可很方便地在熒光顯微鏡下直接觀察。本研究中，以慢病毒載體系統(tǒng)為介導，成功地實現(xiàn)了GFP和熒光素酶在hUCMSC中的共表達，這不僅易化了其相關(guān)體外研究的實時動態(tài)監(jiān)測（熒光顯微鏡觀察）；也極大地方便了通過熒光素酶底物法的活體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的特異性示蹤。此外，初步的表型分析也表明，慢病毒感染并不會造成體外培養(yǎng)的hUC-MSC形態(tài)的明顯改變；同時GFP和熒光素酶共表達慢病毒感染并不會導致細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E1 和p21WAF1/CIP1mRNA表達水平的明顯改變，表明外源GFP和熒光素酶的共表達對體外培養(yǎng)的hUC-MSC生長增殖等表型也無顯著影響。

綜上，本研究建立的hUC-MSC外源GFP和熒光素酶共表達技術(shù)體系在規(guī)避二者示蹤研究中缺點的同時也可有效地結(jié)合二者的優(yōu)點，從而將極大地方便其體內(nèi)外相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床前動物水平的研究。誠然，慢病毒載體系統(tǒng)本身的安全性尚待更進一步的研究以資闡明。

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