3,4苯并芘對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

賈國力 冉華中 季亢挺 王海珠 魏振衡 郁華 王魁風(fēng) 邢程

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一類能分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在微血管新生、損傷血管內(nèi)皮修復(fù)和功能維持中具有重要的作用[1-2]，其數(shù)量及功能的改變影響心血管病的進(jìn)程。3,4-苯并芘（benzo(a)pyrene，BaP）,一種煙草和煤焦油燃燒的副產(chǎn)物，是香煙煙霧的重要組成部分[3]。研究表明，BaP能對(duì)多種細(xì)胞造成損傷，然其對(duì)EPC的影響未見報(bào)道。本研究觀察BaP體外誘導(dǎo)對(duì)EPC生物學(xué)功能的影響，探討吸煙與心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為尋求抑制方案提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

BaP和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所；Transwell小室為美國Corning公司產(chǎn)品。基質(zhì)凝膠（Matrigel）為美國Becton Dickson公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶(orgotein superoxide dismutase,SOD)測(cè)試購自南京建成生物工程研究所。EGM-2培養(yǎng)基為瑞士Lonza公司產(chǎn)品。0.05﹪的胰酶為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。人纖維連接蛋白(humanfibronectin,hFN)為Chemicon公司產(chǎn)品。人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕?。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、M199培養(yǎng)基和PBS液購自美國Gibco公司。其余為市售試劑（級(jí)別：L.R.）。

二、方法

1.EPC的培養(yǎng)[4]及鑒定：人臍帶血采自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院產(chǎn)科病房的健康產(chǎn)婦（足月、順產(chǎn)），經(jīng)產(chǎn)婦及其家屬知情同意，每次采血量約50ml。采用密度梯度離心法分離獲取臍血中的單個(gè)核細(xì)胞沉淀，以含10﹪FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成5×106個(gè)/ml密度的單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先包被好hFN的6孔板中，置于37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，吸棄培養(yǎng)基，并用預(yù)溫的D-Hank液輕輕沖洗2遍，然后添加含10﹪FBS的EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d換半液，待原代細(xì)胞長(zhǎng)至90﹪匯合度時(shí)，便可進(jìn)行傳代。第2代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70﹪～90﹪匯合度時(shí)，用0.05﹪胰酶消化收集，制成1×106個(gè)/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液，將終濃度為2.4 μg/ml的DiI-ac-LDL加入6孔板有蓋玻片的孔中，置于37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中避光孵育1～2h。吸掉培養(yǎng)液，4﹪多聚甲醛固定15min。PBS沖洗2次，每次3min，加入FITCUEA -I lectin(10mg/L)，繼續(xù)避光孵育1h，取出蓋玻片，用PBS輕輕洗掉浮色，加入抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察、拍片。

2.實(shí)驗(yàn)分組：第3代EPC生長(zhǎng)至70﹪～90﹪匯合度時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，以低FBS（含2﹪FBS）的EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化；然后以0.05﹪含EDTA的胰酶消化。收集細(xì)胞，并以含10﹪FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成5×106ml/L密度的單個(gè)細(xì)胞懸液。隨機(jī)分為 5組 ：(1)正常對(duì)照組（Control）：不做任何處理；(2)溶劑對(duì)照組（DMSO，BaP的溶劑）：加入DMSO 濃度為 ：1ml/L ；(3)BaP各組（BaP①、BaP②、BaP③）：BaP濃度分別為 ：10、20、50 μmol/L。細(xì)胞置于37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h，待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至90﹪匯合度時(shí)，進(jìn)行各項(xiàng)細(xì)胞功能檢測(cè)。

3.增殖能力檢測(cè)：待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至90﹪匯合度時(shí)，以0.05﹪含EDTA的胰酶消化收集各組貼壁細(xì)胞，并以低FBS（含2﹪FBS）的EGM-2培養(yǎng)基重懸各組EPC，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，各組均以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種至預(yù)先包被有hFN的96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)調(diào)零孔，同樣設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔只添加含2﹪FBS的EGM-2培養(yǎng)液。然后將96孔板置于37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，吸棄培養(yǎng)基，重新添加含10﹪CCK-8溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，置酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度(A)值。

4.附能力檢測(cè)：各組細(xì)胞均按5000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種至預(yù)先包被hFN的96孔板中，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔；置37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，洗去未貼壁細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野（×200），倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)。

5.遷移能力檢測(cè)：上述各組細(xì)胞制成5×105個(gè) /ml的單細(xì)胞懸液，于24孔板中放入transwell小室 ( 孔徑 8 μm)，下室加入 600μl含10﹪FBS的EGM-2培養(yǎng)基，上室加入100μl上述細(xì)胞懸液；置于37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h；取出transwell小室，D-Hank液淋洗2次，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，4﹪多聚甲醛固定10min；以0.25﹪結(jié)晶紫（crystal violet）染色，置于倒置顯微鏡下觀察、拍片，各組均隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400)，計(jì)數(shù)遷移至下層的細(xì)胞個(gè)數(shù)，以評(píng)價(jià)各組EPC的遷移能力。

6.成血管能力檢測(cè)：（1）Matrigel凝膠的配制：將Matrigel膠置于4℃溶解，將移液器，吸管，槍頭，96孔培養(yǎng)板等置于4℃預(yù)冷；取50μl/孔加入96孔板中（冰上操作），37 ℃孵育1h成膠。（2）EPC成血管能力檢測(cè)：各組細(xì)胞1×105個(gè)/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液，按10000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于鋪被有Matrigel凝膠的96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5﹪CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。取出96孔板，置于倒置顯微鏡下觀察、拍片，各組均隨機(jī)選取5個(gè)視野（×100）計(jì)數(shù)小管形成數(shù)量。

7.細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD的活力檢測(cè)：如上述EPC做分組處理后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以SOD測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活力。操作依據(jù)說明書進(jìn)行，然后置于可見光分光光度儀測(cè)各組吸光度，最后按說明書中換算公式得出統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，EPC的增殖能力、黏附能力、遷移能力、成血管能力以及SOD活力的測(cè)定值等計(jì)量資料均以表示，單因素方差分析比較各組均數(shù)，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EPC的表型及鑒定

顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征：人臍血分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)第4天開始出現(xiàn)細(xì)胞集落，長(zhǎng)程培養(yǎng)形成典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)（圖1a）。Dilac-LDL攝取和FITC-UEA-1 lectin結(jié)合雙熒光染色試驗(yàn)陽性，吞噬DiI-ac-LDL的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)紅色熒光，結(jié)合FITC-UEA-1 lectin的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)綠色熒光。復(fù)合圖像中，lectin熒光主要在胞膜，ac-LDL熒光主要在胞質(zhì)（圖1b）。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察EPC形態(tài)

二、BaP對(duì)EPC遷移能力的影響

EPC分組處理24 h后，采用transwell小室檢測(cè)各組EPC遷移能力的改變，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組[(46.10±4.51)個(gè)/400倍鏡]相比，BaP處理各組EPC的遷移能力均顯著降低[BaP①組 (35.50±4.95)個(gè) /400倍鏡，BaP②組(26.80±4.08)個(gè)/400倍鏡，BaP③組(19.50±2.84)個(gè) /400倍鏡，均 P < 0.01]，隨著BaP作用濃度的增高，EPC的遷移能力呈濃度依賴性降低（均P < 0.01）；而正常對(duì)照組與溶劑對(duì)照組[(44.30±6.62)個(gè)/400倍鏡]之間差異無顯著性（P > 0.05）（圖 2，表 1）。

三、BaP對(duì)EPC成血管能力的影響

各組處理因素作用24 h后，采用Matrigel凝膠體外成血管試驗(yàn)觀察各組EPC體外成血管能力的變化情況，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照 組[(33.20±3.70)個(gè)/100倍 鏡]相 比，BaP呈濃度依賴性降低EPC的成血管能力{[BaP①組 (22.00±3.39)個(gè) /100倍 鏡，BaP②組 (16.20±2.59)個(gè) /100倍 鏡，BaP③組(10.80±2.39)個(gè) /100倍鏡，均 P < 0.01]，BaP染毒組間成血管能力差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(兩兩比較，均 P < 0.05)}（圖 3，表 1）。

四、BaP對(duì)EPC增殖能力的影響

處理因素作用24 h后，采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)各組EPC的增殖能力改變，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組[(A)值為(1.02±0.04)]相比，BaP各組EPC的增殖能力均顯著降低 [BaP ① 組 (A) 值 為 (0.66±0.04)，BaP②組 OD(0.55±0.04)，BaP ③ 組 (A) 值 為(0.35±0.05)，均 P < 0.01]，隨著 BaP 濃度的加大，EPC的增殖能力也逐漸降低，呈明顯濃度依賴性（均 P < 0.01，表 1）。

五、BaP對(duì)EPC黏附能力的影響

EPC分組處理24 h后，顯微鏡下貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察各組細(xì)胞的黏附能力改變，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組[(117.50±17.16)個(gè)/200倍鏡]相比，BaP呈濃度依賴性降低EPC的黏附能 力 [BaP①組 (80.00±14.46)個(gè) /200倍 鏡，BaP②組(66.00±9.06)個(gè)/200倍鏡，BaP③組(49.80±10.72)個(gè) /200倍 鏡，均 P < 0.01，BaP染毒組間黏附能力差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(兩兩比較，均P < 0.05)]。正常對(duì)照組與溶劑對(duì)照組[(117.20±20.64)個(gè)/200倍鏡]之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05，表 1）。

表1 BaP對(duì)EPC增殖、黏附、遷移及成血管能力的影響（）

表1 BaP對(duì)EPC增殖、黏附、遷移及成血管能力的影響（）

注：BaP為3,4-苯并芘，BaP①組濃度為10 μmol/L，BaP②組濃度為20 μmol/L，BaP③組濃度為50 μmol/L，與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；BaP染毒組間比較，bP<0.05

分組 增殖能力（n=6）（OD值）黏附能力（n=10）（細(xì)胞個(gè)數(shù)）遷移能力(n=10)（細(xì)胞個(gè)數(shù)）成血管能力（n=5）（小管數(shù)）正常對(duì)照組 1.02±0.04 117.50±17.16 46.10±4.51 33.20±3.70溶劑對(duì)照組 1.01±0.03 117.20±20.64 44.30±6.62 31.80±3.96 BaP染毒組BaP①組 0.66±0.04ab 80.00±14.46ab 35.50±4.95ab 22.00±3.39ab BaP②組 0.55±0.04ab 66.00±9.06ab 26.80±4.08ab 16.20±2.59ab BaP③組 0.35±0.05ab 49.80±10.72ab 19.50±2.84ab 10.80±2.39ab F 值 314.158 41.188 56.875 62.707 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 BaP呈濃度依賴性降低EPC遷移能力（個(gè)/400倍鏡）

六、細(xì)胞培養(yǎng)上清液SOD活力的變化

處理因素作用24 h后，取上清液，采用SOD測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)培養(yǎng)上清液中SOD的活力水平，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組[(22.6±2.19)U/ml]相比，BaP能明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD的活力水平 [BaP ①組 (15.94±1.68)U/ml，BaP ②組(12.5±1.58)U/ml，BaP ③組 (6.9±1.55)U/ml，均P < 0.01]，隨著BaP濃度的加大，上清液中SOD的活力水平顯著降低，呈明顯濃度依賴性。（均P < 0.01）。

討 論

BaP是一種典型的多環(huán)芳烴類化合物，是香煙煙霧和汽車尾氣的重要成分，其對(duì)人體健康的危害一直是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。BaP進(jìn)入細(xì)胞后，其代謝產(chǎn)物可阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞形態(tài)的改變，溶酶體受損，細(xì)胞膜破壞，DNA損傷等，從而導(dǎo)致不同組織和器官的損害，影響人體的健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BaP可引起血管壁的病理學(xué)改變[6]，BaP和它的代謝產(chǎn)物具有促炎癥作用，可導(dǎo)致組織和細(xì)胞中諸如巨噬細(xì)胞侵潤、MMP表達(dá)的上升、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-Kappa B）的激活[7-8]等生物學(xué)反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮的損傷。

內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的開始，血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)皮修復(fù)極為重要，內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程除了原先存在的鄰近成熟內(nèi)皮細(xì)胞的出芽或遷移外，也可以通過EPC分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞參與修復(fù)損傷的內(nèi)皮。EPC又名成血管細(xì)胞，是指出生后機(jī)體中存在的能特異性歸巢于血管新生組織并分化成內(nèi)皮細(xì)胞的一群干/祖細(xì)胞，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體。EPC具有內(nèi)皮細(xì)胞特性，能黏附于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿，可通過貼壁培養(yǎng)法從單個(gè)核細(xì)胞中分離培養(yǎng)。筆者實(shí)驗(yàn)室已通過流式細(xì)胞儀鑒定此法培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)EPC公認(rèn)特異性標(biāo)志CD34＋/CD133＋/VEGFR-2＋[9]，此次再以Dil-ac-LDL/FITC-UEA -I lectin雙熒光染色進(jìn)一步證實(shí)。EPC參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程，加速內(nèi)膜損傷血管的再內(nèi)皮化，并減少新生內(nèi)膜的形成[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)，新生血管中25﹪的內(nèi)皮細(xì)胞是由EPC分化而來的[11]。正常情況下內(nèi)皮損傷與EPC修補(bǔ)之間存在動(dòng)態(tài)平衡，維持著內(nèi)膜的完整性，然而動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各種危險(xiǎn)因素可通過多種途徑對(duì)循環(huán)中EPC的數(shù)量和生物學(xué)功能造成影響[12]。

吸煙是心血管病的重要危險(xiǎn)因素，研究證實(shí)BaP可引起內(nèi)皮的損傷。本實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)BaP暴露對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞這個(gè)內(nèi)皮損傷與修復(fù)平衡中最重要的角色有損傷作用。在體外誘導(dǎo)試驗(yàn)中，BaP呈劑量依賴性地降低了內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、黏附、遷移及成血管能力。與此同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD的活力也相應(yīng)降低，似乎提示BaP對(duì)EPC細(xì)胞功能學(xué)的影響與氧化損傷有關(guān)。

綜上所述，BaP對(duì)EPC各種生物學(xué)功能的損傷，可能會(huì)打破內(nèi)皮損傷與EPC修補(bǔ)之間的動(dòng)態(tài)平衡，這可能是BaP引起血管壁病變的原因之一。而BaP是香煙煙霧的重要成分，這也提示吸煙這一不良嗜好引起動(dòng)脈粥樣硬化的原因可能與BaP對(duì)血管壁的損傷有關(guān)。有關(guān)BaP對(duì)EPC各種生物學(xué)功能損傷機(jī)制的深入研究有利于相應(yīng)抑制方案的篩選，這對(duì)于煙民眾多且尾氣污染日重的現(xiàn)狀有其深刻意義。

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