細(xì)胞毒性試驗(yàn)多孔平行數(shù)據(jù)異常值檢驗(yàn)方法的比較

管 瑩，夭建華，朱洲海，米其利，曾婉俐，黃海濤，高 茜，李雪梅

（云南煙草科學(xué)研究院，云南 昆明650106）

生物實(shí)驗(yàn)中為了實(shí)現(xiàn)高通量的測(cè)定，常以多孔板作為實(shí)驗(yàn)的工具載體，其檢測(cè)體系可低至微升級(jí)樣品量，通量可擴(kuò)充至1536孔板。該檢測(cè)手段使得研究者可以在一次試驗(yàn)中獲得多個(gè)平行檢測(cè)數(shù)據(jù)，但伴隨著通量的提高，檢測(cè)體系的體積相應(yīng)減小，較小的檢測(cè)體系的穩(wěn)定性也有所下降。細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為一類重要的體外實(shí)驗(yàn)，廣泛應(yīng)用于評(píng)定食品、藥品、化妝品對(duì)細(xì)胞的毒性作用［1－3］。該試驗(yàn)是將受試物加入到種植有受試細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，通過檢測(cè)受試物對(duì)細(xì)胞存活率的影響，來判定受試物的細(xì)胞毒性。由于在將受試細(xì)胞種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的過程中，很難保證接種到每孔中的細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)完全一致，可能會(huì)導(dǎo)致在同一批平行檢測(cè)的數(shù)據(jù)中有個(gè)別數(shù)據(jù)與其它數(shù)據(jù)明顯不一致，這種數(shù)據(jù)稱為異常值，也稱為異常數(shù)據(jù)或離群值［4］。實(shí)際運(yùn)用中，當(dāng)檢測(cè)數(shù)據(jù)中存在與其它檢測(cè)值差異較大的數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)首先排除檢測(cè)過程中操作技術(shù)、儀器故障、數(shù)據(jù)計(jì)算、筆誤等產(chǎn)生的誤差［5］。未經(jīng)正式統(tǒng)計(jì)分析處理就將主觀上認(rèn)為異常的值任意舍棄的做法是不可取的，這樣做表面上得到了分散很小、精密度很高的結(jié)果，但實(shí)質(zhì)上可能降低了重復(fù)測(cè)量得到的平均值的準(zhǔn)確度，以相同條件再次檢測(cè)時(shí)，超過該誤差指標(biāo)范圍的“異常值”必然還會(huì)再次出現(xiàn)。

如何評(píng)估檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性是統(tǒng)計(jì)學(xué)研究的重要課題，也是當(dāng)前檢測(cè)工作中普遍關(guān)心的問題。選取適當(dāng)?shù)漠惓Ｖ禉z驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析就尤為重要。鑒于此，作者對(duì)常用的5種異常值檢驗(yàn)方法的適用情況及對(duì)同一組細(xì)胞毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)異常值的檢出進(jìn)行了比較研究，以期為相關(guān)科研工作者選取適當(dāng)異常值檢驗(yàn)方法提供依據(jù)。

1 異常值的判別方法［6］

1．1 拉依達(dá)（Pauta）準(zhǔn)則

拉依達(dá)準(zhǔn)則又稱3σ準(zhǔn)則，該準(zhǔn)則檢驗(yàn)數(shù)據(jù)基于正態(tài)分布，根據(jù)正態(tài)分布理論｜vd｜≤3σ的概率為99．7%，因此在有限檢測(cè)中，某次檢測(cè)值的誤差大于3σ的幾率僅為0．3%，則認(rèn)為該檢測(cè)值為粗大誤差值的異常值，需剔除。

當(dāng)檢測(cè)次數(shù)n較大時(shí)，該準(zhǔn)則簡(jiǎn)單易行，是比較實(shí)驗(yàn)中的常用方法。但當(dāng)n不太大時(shí)，檢測(cè)數(shù)據(jù)中即使存在誤差較大的異常值也很難被檢出，由于貝塞爾公式意味著≤3σ，異常值無法檢出。

由此表明，當(dāng)重復(fù)檢測(cè)值較少時(shí)，不宜使用拉依達(dá)準(zhǔn)則，特別是當(dāng)n≤10時(shí)，拉依達(dá)準(zhǔn)則完全無法檢出異常值。但樣本量較大時(shí)，用拉依達(dá)準(zhǔn)則對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的異常值進(jìn)行初篩最為簡(jiǎn)便［7］。

1．2 肖維勒（Chauvenet）準(zhǔn)則

肖維勒準(zhǔn)則也是以數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布為前提。假設(shè)多次重復(fù)測(cè)量所得的n個(gè)檢測(cè)值中，某個(gè)檢測(cè)值的殘余誤差｜ΔXi｜＞Zcσ，則剔除此數(shù)據(jù)。其中Zc是樣本容量為n時(shí)的判別系數(shù)，可以由Zc值表獲取。肖維勒準(zhǔn)則在一定程度上彌補(bǔ)了拉依達(dá)準(zhǔn)則的不足，可以用于n≤10時(shí)對(duì)異常值進(jìn)行判定。相對(duì)于拉依達(dá)準(zhǔn)則，肖維勒準(zhǔn)則更為嚴(yán)格。

1．3 格拉布斯（Grubbs）準(zhǔn)則

格拉布斯準(zhǔn)則與肖維勒準(zhǔn)則相似，但判定系數(shù)不同。格拉布斯準(zhǔn)則中假設(shè)多次重復(fù)測(cè)量所得的n個(gè)檢測(cè)值中，當(dāng)某個(gè)檢測(cè)值的殘余誤差｜ΔXi｜＞T0σ，則剔除此數(shù)據(jù)。T0是樣本容量為n時(shí)的判別系數(shù)，可以由T0（n，α）值表獲取，與肖維勒準(zhǔn)則中Zc值判定系數(shù)不同的是T0值與重復(fù)測(cè)量次數(shù)n和置信概率α均相關(guān)，格拉布斯準(zhǔn)則概率意義更為明確。格拉布斯準(zhǔn)則也要求檢測(cè)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。

1．4 狄克遜（Dxion）準(zhǔn)則

狄克遜準(zhǔn)則也是以數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布為前提，通過極差比判定和剔除異常數(shù)據(jù)。假設(shè)有一組測(cè)量數(shù)據(jù)，從小到大依次排列有X1≤X2≤…≤Xn，且為正態(tài)分布，則可能為異常值的檢測(cè)數(shù)據(jù)必然出現(xiàn)在兩端，即X1或Xn。與一般比較簡(jiǎn)單極差的方法不同，狄克遜準(zhǔn)則為了提高判斷效率，對(duì)不同樣本量應(yīng)用不同的極差比公式進(jìn)行計(jì)算，見表1。

表1 不同樣本量對(duì)應(yīng)的極差比公式Tab．1 Formula of different sample sizes

在確定檢驗(yàn)水平α后查表得出臨界值D1－α（n），分別檢驗(yàn)高端值 Dn和低端值 D′n，當(dāng) Dn＞D1－α（n）或D′n＞D1－α（n）時(shí)判定 Xn或 X1為異常值，反之則無異常值檢出。

1．5 羅馬諾夫斯基（t檢驗(yàn)）準(zhǔn)則

羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則也是將最小檢測(cè)數(shù)據(jù)與最大檢測(cè)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行檢驗(yàn)，如｜X1－｜＞K（n，α）σ′或｜Xn－｜＞K（n，α）σ′則判定X1或Xn為異常值。式中X′和σ′分別為不包含X1或Xn的n－1個(gè)數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差；K（n，α）為臨界值，其中n為樣本容量、α為置信度，K（n，α）值可通過查表獲得。

這種檢驗(yàn)方法是將X1或Xn暫時(shí)刪去后進(jìn)行計(jì)算，這樣既保證σ′的正確性又保證了其獨(dú)立性。

2 各準(zhǔn)則檢驗(yàn)步驟及應(yīng)用實(shí)例

表2給出的測(cè)量數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室某次MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞對(duì)照組的16個(gè)平行孔于490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的吸光值。以下分別用拉依達(dá)準(zhǔn)則、肖維勒準(zhǔn)則、格拉布斯準(zhǔn)則、狄克遜準(zhǔn)則、羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則對(duì)該組數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，判斷是否存在異常值。

表2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)同一劑量平行孔測(cè)量結(jié)果Tab．2 Detection results of cytotoxicity parallel

2．1 拉依達(dá)準(zhǔn)則檢驗(yàn)步驟及結(jié)果

（1）計(jì)算算術(shù)平均值：

（2）計(jì)算剩余誤差及3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：

（3）計(jì)算結(jié)果表明，16個(gè)檢測(cè)值中14＃測(cè)量值剩余誤差最大，為0．7255，但仍小于3σ（0．8549），根據(jù)拉依達(dá)準(zhǔn)則該組數(shù)據(jù)中無異常值。

2．2 肖維勒準(zhǔn)則檢驗(yàn)步驟及結(jié)果

（1）計(jì)算算術(shù)平均值：

（2）計(jì)算剩余誤差及標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：

（3）對(duì)應(yīng)Zc值表，當(dāng)樣本量n＝16時(shí)對(duì)應(yīng)的Zc值為2．15，故Zcσ＝2．15×0．2850＝0．6127。

（4）計(jì)算結(jié)果表明，16個(gè)檢測(cè)值中14＃、15＃測(cè)量值剩余誤差分別為0．7255、0．6595，均大于Zcσ（0．6127），根據(jù)肖維勒準(zhǔn)則該組14＃、15＃測(cè)量數(shù)據(jù)1．688、0．303為可疑值，任意選擇剔除其中一個(gè)值后繼續(xù)檢測(cè)，本例中首先剔除1．688。

（5）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余15個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢出可疑值0．303、0．640、1．291，任意選擇剔除其中一個(gè)值后繼續(xù)檢測(cè)，本例中首先剔除0．303。

（6）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余14個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢出可疑值0．640、1．291，任意選擇剔除其中一個(gè)值后繼續(xù)檢測(cè)，本例中首先剔除1．291。

（7）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余13個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢出可疑值0．640，剔除后繼續(xù)檢測(cè)。

（8）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余12個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，無異常值檢出。

根據(jù)肖維勒準(zhǔn)則共剔除4個(gè)異常值，分別為0．303、0．640、1．291、1．688。

2．3 格拉布斯準(zhǔn)則檢驗(yàn)步驟及結(jié)果

（1）確定置信概率α為0．05。（2）計(jì)算算術(shù)平均值：

（3）計(jì)算剩余誤差及標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：

（4）查表獲得T0（16，0．05）值并計(jì)算T0σ：對(duì)應(yīng)T0（n，α）值表，當(dāng)樣本量n＝16、置信概率α為0．05時(shí)，對(duì)應(yīng)的 T0值為2．44，故 T0σ＝2．44×0．2850＝0．6953。

（5）計(jì)算結(jié)果表明，16個(gè)檢測(cè)值中14＃測(cè)量值的剩余誤差為0．7255，大于T0σ（0．6953），根據(jù)格拉布斯準(zhǔn)則應(yīng)予以剔除。

（6）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余15個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除0．303。

（7）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余14個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除1．291。

（8）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余13個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除0．640。

（9）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余12個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，無異常值檢出。

根據(jù)格拉布斯準(zhǔn)則共剔除4個(gè)異常值，分別為0．303、0．640、1．291、1．688。

2．4 狄克遜準(zhǔn)則檢驗(yàn)步驟及結(jié)果

（1）確定置信概率α為0．05。

（2）將 16 個(gè)數(shù)據(jù)從小到大依次排序：0．303、0．640、0．854……1．080、1．291、1．688。

（3）根據(jù)樣本量選擇極差比公式：該組數(shù)據(jù)樣本量為16，屬于14≤n≤30范圍內(nèi)，故選擇公式分別對(duì)高端和低端異常值進(jìn)行檢驗(yàn)。

（4）計(jì)算Dn和D′n值，并確定較大值。

根據(jù)計(jì)算結(jié)果Dn＞D′n。

（5）查表獲得D0．95值為0．547。

（6）根據(jù)狄克遜準(zhǔn)則剔除異常值：由于Dn＞D0．95（16）故該組數(shù)據(jù)中最大值1．688應(yīng)予剔除。

（7）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余15個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除0．303。

（8）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余14個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除1．291。

（9）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余13個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除0．640。

（10）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余12個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，無異常值檢出。

根據(jù)狄克遜準(zhǔn)則共剔除4個(gè)異常值，分別為0．303、0．640、1．291、1．688。

2．5 羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則檢驗(yàn)步驟及結(jié)果

（1）確定置信概率α為0．05。

（2）將 16 個(gè)數(shù)據(jù)從小到 大依次排序：0．303、0．640、0．854……1．080、1．291、1．688。

（3）暫時(shí)去除X1后計(jì)算、σ′分別為1．0065、0．2321；｜X1－｜＝｜0．303－1．0065｜＝0．7035。

（4）經(jīng)查表，當(dāng)樣本容量為16時(shí)，K 值為2．22，計(jì)算得到K（n，α）σ′值為0．5153。

（5）根據(jù)判定準(zhǔn)則剔除異常值：由于｜X1－｜（0．7035）大于 K（n，α）σ′（0．5153），故判定0．303為異常值，予以剔除。

（6）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余15個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除1．688。

（7）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余14個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除1．291。

（8）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余13個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除0．640。

（9）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余12個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，剔除1．080。

（10）根據(jù)上述步驟繼續(xù)對(duì)剩余11個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，無異常值檢出。

根據(jù)羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則共剔除5個(gè)異常值，分別為0．303、0．640、1．080、1．291、1．688。

2．6 討論

以上判定準(zhǔn)則都是以數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布為前提，當(dāng)數(shù)據(jù)偏離正態(tài)分布時(shí)檢驗(yàn)結(jié)果不一定可靠。

從樣本量的適用情況來看，拉依達(dá)準(zhǔn)則不需查表，計(jì)算最為簡(jiǎn)便，但結(jié)果可靠性不高，尤其是在樣本量較小時(shí)，因此拉依達(dá)準(zhǔn)則通常用于樣本量較大且對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果要求不太高時(shí)對(duì)大量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行初篩；樣本量較小時(shí)選擇狄克遜準(zhǔn)則、羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則對(duì)離群值的判定功效較優(yōu)，肖維勒準(zhǔn)則、格拉布斯準(zhǔn)則檢驗(yàn)樣本量適中，但這一區(qū)分并不十分嚴(yán)格。細(xì)胞毒性試驗(yàn)多孔平行數(shù)據(jù)通常屬于較小樣本量，在實(shí)際運(yùn)用中選擇拉依達(dá)準(zhǔn)則對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)是不合適的。

從計(jì)算方式來看，肖維勒準(zhǔn)則、格拉布斯準(zhǔn)則、羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則都需要計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，并通過查表獲得一個(gè)系數(shù)以此來計(jì)算相應(yīng)臨界值Xσ。對(duì)這三種準(zhǔn)則分別對(duì)應(yīng)的Zc值、T0值、K值表進(jìn)行比較，羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則最為嚴(yán)格，其次是肖維勒準(zhǔn)則，格拉布斯準(zhǔn)則相對(duì)較為寬泛［8］。除此之外，肖維勒準(zhǔn)則所對(duì)應(yīng)的Zc值大小只與樣本量n相關(guān)，置信概率α對(duì)Zc值無影響，相較格拉布斯準(zhǔn)則、羅馬諾夫斯基準(zhǔn)則以及狄克遜準(zhǔn)則，肖維勒準(zhǔn)則概率意義較為模糊。

從檢出離群值的個(gè)數(shù)來看，以上5種判定準(zhǔn)則均可以通過重復(fù)使用對(duì)可疑值進(jìn)行逐一檢出，但重復(fù)使用同一檢驗(yàn)法可能犯判多為少的錯(cuò)誤，重復(fù)檢驗(yàn)時(shí)狄克遜準(zhǔn)則較好，但計(jì)算相對(duì)復(fù)雜［4］。

3 結(jié)論

細(xì)胞毒性試驗(yàn)多孔平行數(shù)據(jù)屬于小樣本量數(shù)據(jù)，待檢出的異常值不僅限于1個(gè)。根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)多孔平行數(shù)據(jù)的特點(diǎn)綜合考慮這5種準(zhǔn)則的適用范圍、計(jì)算方式、嚴(yán)格程度，選用狄克遜準(zhǔn)則較為適宜，該準(zhǔn)則概率意義明確，適用于對(duì)樣本量較小的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，且在需要對(duì)1個(gè)以上異常值進(jìn)行檢出時(shí)效果較好。值得注意的是，雖然可以通過重復(fù)利用狄克遜準(zhǔn)則對(duì)數(shù)據(jù)中的多個(gè)異常值進(jìn)行逐個(gè)檢出，但在一組檢出數(shù)據(jù)中，可疑數(shù)據(jù)應(yīng)很少，若一組數(shù)據(jù)中的可疑數(shù)據(jù)較多，則提示數(shù)據(jù)測(cè)量體系可能異常，可考慮重新測(cè)量。

［1］林祥梅，王建峰，梅琳，等．用人角質(zhì)細(xì)胞評(píng)價(jià)4種化妝品的細(xì)胞毒性［J］．毒理學(xué)雜志，2008，22（1）：75－76．

［2］夭建華，陳輝敏，方力，等．國(guó)內(nèi)外卷煙危害性評(píng)價(jià)方法現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)［J］．煙草科技，2007，（1）：50－53．

［3］蘇建青，褚秀玲，李俊霞，等．中性紅染色法檢測(cè)人參皂苷及其衍生物對(duì)CEF增殖的影響［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（35）：17523－17525．

［4］GB／T 4883－2008，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理和解釋 正態(tài)樣本離群值的判斷與處理［S］．

［5］馬林茂．?dāng)?shù)據(jù)處理中異常值的取舍［J］．疾病監(jiān)測(cè)，2010，（12）：992－993．

［6］樂立利．觀測(cè)數(shù)據(jù)的異常值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法研究［D］．長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2008．

［7］熊萬(wàn)杰，黃振中．用Origin軟件處理物理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［J］．大學(xué)物理實(shí)驗(yàn)，2004，17（2）：65－67．

［8］何平．剔除測(cè)量數(shù)據(jù)中異常值的若干方法［J］．航空計(jì)測(cè)技術(shù)，1995，（15）：19－22．