等溫滴定微量熱檢測中樣品預處理的優(yōu)化研究

周 潔，付 強，玉延華

（廣西大學 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧530004）

生物大分子之間或生物大分子與外源物質(zhì)之間的反應熱極其微弱，需要用高度敏感的熱分析技術(shù)才能測定。目前常用的研究生物分子反應的方法，如表面等離子共振技術(shù)（Surface plasmon resonance，SPR）［1］和超速離心分析技術(shù)［2］等，均要求蛋白質(zhì)固定于表面，這就會干擾蛋白質(zhì)間的結(jié)合，或耗費很長時間。等溫滴定微量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）是近年來發(fā)展起來的一種研究生物分子相互作用的重要方法［3］，其優(yōu)勢在于其非特異性、樣品用量小、方法靈敏度和精確度高、實驗時間較短、操作簡單等。ITC的非特異性有助于新現(xiàn)象和新規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，特別適用于研究生物體系中的各種特異過程；但也會導致實驗中產(chǎn)生由反應環(huán)境造成的“背景”，干擾性大，難以獲得目標反應的理想檢測數(shù)據(jù)。要排除ITC的非特異性產(chǎn)生的不利影響，有必要對檢測樣品的預處理進行優(yōu)化，創(chuàng)造一個“相對零背景”的反應系統(tǒng)。

作者以人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）［4］與鋅離子的相互作用為研究對象，對ITC檢測樣品預處理進行了優(yōu)化研究，以期獲得更高效、更理想的檢測數(shù)據(jù)。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

人血清白蛋白（HSA），Sigma公司；硫酸鋅（分析純），華大；實驗用水為去離子水。將Tris－HCl（Solarbio，1×103mmol·L－1，pH＝7．4）配制成5mmol·L－1緩沖溶液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

iTC200型等溫滴定微量熱儀，GE；Lambda 35型紫外分光光度計，Perkin Elmer。

1．2 樣品預處理方法

A組：用5mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液配制0．05mmol·L－1HSA溶液200μL、2．5mmol·L－1硫酸鋅溶液40μL，直接用于反應。

B組：（1）用5mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液配制0．2mmol·L－1HSA溶液2mL，用透析卡（Thermo，Slide－A－Lyzer○RDialysis Cassette，3500MWCO，0．5～3mL Capacity）進行3次透析，透析緩沖溶液為5mmol·L－1Tris－HCl，每次使用體積600mL，透析條件為：第1次，4℃，2h，更換緩沖溶液；第2次，4℃，2h，更換緩沖溶液；第3次，4℃過夜，透析完成后的Tris－HCl緩沖溶液于4℃儲存?zhèn)溆?。用專用注射器從透析卡中吸出HSA溶液，采用Bradford法測定HSA實際濃度。以第3次透析后存儲的Tris－HCl緩沖溶液為溶劑，將經(jīng)過3次透析的HSA溶液稀釋至濃度0．05mmol·L－1。（2）同法用此 Tris－HCl緩沖溶液配制濃度為2．5mmol·L－1的硫酸鋅溶液。（3）測定配制好的HSA溶液和硫酸鋅溶液的pH值，若兩者不一致，則調(diào)節(jié)pH值至相差不超過0．05。

1．3 ITC檢測方法

A組：在iTC 200軟件中的 Advance Experimental Design設置ITC實驗參數(shù)：0．05mmol·L－1HSA溶液200μL，2．5mmol·L－1硫酸鋅40μL；反應溫度25℃；總注射次數(shù)19次；參照功率5μcal·s－1；攪拌器轉(zhuǎn)速1000r·min－1。結(jié)果用 Origin（MicroCal，LLC ITC200）軟件進行分析，得到結(jié)合常數(shù)（Kb）、反應的化學計量數(shù)（N）、熵（ΔS）和焓（ΔH）。

圖1 HAS－Zn2＋相互作用的ITC檢測結(jié)果Fig．1 The ITC determination results for HSA－Zn2＋interaction

B組：首先，利用iTC 200軟件的Experimental Design模塊進行實驗預測。Experimental Mode選擇Highest Quality，在 Estimate Kd中的 Cell Compound選擇 Protein，Syringe Compound 選擇 Small Molecule，預估 ΔH 為1kcal·mol－1。鍵入不同的Cell、Syringe濃度值可得到不同實驗預測反應曲線，根據(jù)預測曲線選擇適合的濃度值。進行實驗預測后，選擇HSA 0．05mmol·L－1、硫酸鋅2．5mmol·L－1作為反應濃度。然后根據(jù)預估結(jié)果，在Advance Experimental Design中設置ITC實驗參數(shù)：0．05mmol·L－1HSA溶液200μL，2．5mmol·L－1硫酸鋅40μL；反應溫度25℃；總注射次數(shù)19次；參照功率5μcal·s－1；攪拌器轉(zhuǎn)速1000r·min－1。結(jié) 果 用 Origin（MicroCal，LLC ITC200）軟件進行分析，得到結(jié)合常數(shù)（Kb）、反應的化學計量數(shù)（N）、熵（ΔS）和焓（ΔH）。

2 結(jié)果與討論

2．1 ITC檢測結(jié)果

將HSA與硫酸鋅分別按A、B組方案進行樣品預處理和ITC檢測，結(jié)果見圖1，獲得的結(jié)合參數(shù)見表1。

由圖1可知，A組HSA－Zn2＋相互作用過程中反應峰值始終較大，表現(xiàn)出反應一直沒有達到平衡狀態(tài)，難以從滴定曲線判斷結(jié)合類型，同時沒有獲得有效的數(shù)據(jù)（表1），無法對分子間相互作用力進行推斷，因此認為A組檢測結(jié)果不可用。

由圖1還可知，B組 HSA－Zn2＋相互作用的特征性的峰序列表現(xiàn)出良好的臺階，并最終顯示滴定接近平衡，反應飽和，殘余的熱效應符合稀釋峰的特征，可以通過Origin軟件的非線性回歸分析減掉。表1數(shù)據(jù)表明，B組 HSA－Zn2＋為放熱反應［5］，只有一個結(jié)合位點，是一個焓驅(qū)動的過程（ΔH＜0），同時根據(jù)公式ΔG＝ΔH－TΔS［6］，Gibbs結(jié)合能ΔG＜0主要由ΔH＜0貢獻，因而推斷，在本實驗設計的濃度和比例下，HSA與Zn2＋之間主要的作用力為氫鍵和范德華力［7］。

表1 HSA－Zn2＋相互作用的結(jié)合參數(shù)Tab．1 The binding parameters for HSA－Zn2＋interaction

2．2 討論

在ITC檢測實驗中，良好的反應系統(tǒng)是得到理想結(jié)果的關鍵，但要實現(xiàn)“絕對零背景”很難，而創(chuàng)造“相對零背景”的系統(tǒng)則可以通過對樣品預處理的優(yōu)化來實現(xiàn)。經(jīng)過透析、濃度測定、pH值調(diào)節(jié)等一系列預處理的B組HSA－Zn2＋獲得了良好的ITC檢測結(jié)果。

（1）HSA粉劑中的甘油、防凍劑等輔分可能對另一反應物產(chǎn)生作用或?qū)φ麄€反應體系產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生額外的熱量，成為不屬于特異性反應的背景熱。而其它通過提取及純化的蛋白樣品由于提取試劑的影響，同樣存在背景熱。本研究中蛋白經(jīng)過3次透析后，不僅被Tris－HCl緩沖溶液充分溶解且與緩沖溶液體系達到了很好的平衡。利用第3次透析的緩沖溶液作為另一反應物的溶劑保證了兩種反應物在體系上達到了更好的一致性，是實現(xiàn)“相對零背景”系統(tǒng)的關鍵。

（2）由于ITC檢測的是活性蛋白與小分子作用所產(chǎn)生的反應熱，需要提供給分析軟件的數(shù)據(jù)只有兩個反應物的濃度值，因此，透析后對蛋白濃度再次進行定量以得到準確的濃度非常必要。

（3）由于不能排除反應物在被緩沖溶液溶解或稀釋后是否會發(fā)生pH值變化，相對于生物分子間相互作用的微量結(jié)合熱，酸堿中和熱無法忽略，會成為干擾，因此在ITC實驗中，嚴格調(diào)控pH差值在0．05之內(nèi)很重要。

（4）透析可以選擇透析袋或透析卡，透析袋價格便宜，但使用前需要進行預處理，導致透析步驟增加，影響樣品質(zhì)量和實驗重復性的因素增多。透析卡價格較貴，但人為影響小，便于進行質(zhì)量控制，提高實驗重復性，對于重要樣品，建議使用透析卡等預制品。

3 結(jié)論

等溫滴定微量熱法（ITC）是近年來發(fā)展起來的一種研究生物分子相互作用的重要方法。在研究蛋白質(zhì)與外源小分子的相互作用時，優(yōu)化樣品的預處理，通過將蛋白質(zhì)進行3次透析、準確定量蛋白質(zhì)實際濃度、調(diào)控pH值和使用第3次透析緩沖溶液作為溶劑，實現(xiàn)了“相對零背景”的反應系統(tǒng)。將未優(yōu)化組和優(yōu)化處理組樣品所進行的ITC檢測結(jié)果進行比較，表明進行樣品預處理的優(yōu)化對獲得有效的檢測結(jié)果十分必要。

（致謝：感謝何容博士、任薇薇博士對本研究的理論指導和技術(shù)支持。）

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