稠油厭氧降解產甲烷菌群的組成及產甲烷特性

顧貴洲，張 強，劉春爽，胡恒宇，趙東風

（1．中國石油大學（華東）化學工程學院，山東 青島266555；2．遼寧石油化工大學環(huán)境與生物工程學院，遼寧 撫順113001）

經歷二次和三次采油之后，許多老油氣田面臨廢棄，尤其是一些稠油甚至超稠油油田，無論技術如何更新，仍有50%以上的原油無法回收，而油田一旦廢棄，這些儲量將永遠失去［1］。殘余低品位稠油微生物氣化技術是近幾年來國際上正在探索的延長油藏開發(fā)壽命的新技術，它是利用產甲烷微生物菌群在厭氧環(huán)境下將殘余稠油轉化為天然氣，然后以天然氣形式開采或作為戰(zhàn)略性資源就地儲備［2］。作為國內外研究熱點，石油烴生物氣化的可行性已經在實驗室條件下得到證實［3－5］。研究表明［6－9］，原 油 厭 氧 降 解 產 甲 烷 過 程 需 要由不同功能菌群共同參與、協(xié)同作用才能完成，這種協(xié)同作用主要分為2個階段：（1）降解階段，即石油烴降解為小分子有機物；（2）產氣階段，即小分子物質最終轉化成甲烷等氣體。雖然國內外對石油烴厭氧降解產甲烷研究較多［10－12］，但原油氣化開采一般針對經歷過三采后的老油田，油品更稠、膠質與瀝青質含量更高，開采難度更大，因而目前國際上以稠油為氣化對象的還比較少。因此，富集獲得高效稠油降解產甲烷混合菌群是殘余低品位稠油微生物氣化技術的關鍵。

作者從勝利油田某區(qū)塊油井采出水中篩選獲得一組高效稠油降解產甲烷混合菌群，考察混合菌群的組成，并探討其產甲烷特性，以期為殘余低品位稠油微生物氣化奠定基礎。

1 實驗

1．1 樣品來源、儀器與培養(yǎng)基

實驗樣品來源于勝利油田某區(qū)塊油井采出水，該區(qū)塊地質信息見表1。采出液通過采樣井的井口閥門收集到10L采樣桶中，待采樣桶完全被油水混合物充滿后，密封，快速送回實驗室4℃下保存。

通用突變檢測系統(tǒng)，美國DCode；凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂；Allegra 25R型高速冷凍離心機，美國Beckman；GC－3800型氣相色譜儀，美國 Varian；OIL－510型全自動紅外分光測油儀，北京華夏科創(chuàng)儀器技術有限公司。

無機鹽培養(yǎng)基（g）：K2HPO45．0，KH2PO45．0，NH4Cl 5．0，NaCl 10，MgCl22．0，CaCl20．1，H2O 1000mL，pH值7．0～7．5。

1．2 混合菌群的富集

以油田采出水為接種物富集培養(yǎng)，接種量按20%（體積分數(shù)）接種到厭氧瓶中，加入2mL原油，每個樣品設置3個平行實驗，于55℃生化培養(yǎng)箱暗室培養(yǎng)380d。

表1采樣區(qū)塊地質信息Tab．1 Geological information of sampling block

1．3 單菌株分離

運用亨蓋特厭氧滾管技術［13，14］對混合菌群進行單菌株分離。具體方法為：在無機鹽培養(yǎng)基中補加2%瓊脂粉，分裝于厭氧試管（4．5mL培養(yǎng)基／管），滅菌。置厭氧試管于沸水浴至瓊脂完全熔化。轉到55℃的水浴鍋中，補加Na2S·9H2O至終濃度為0．03%（質量濃度）；補加 NaHCO3至終濃度為0．2%（質量濃度）。滾管，將滾好的所有厭氧試管靜置2h以上，使培養(yǎng)基表面的液體被充分吸收。接種后于55℃暗箱培養(yǎng)。

1．4 菌群結構分析

使用Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取混合菌群總DNA。以細菌16SrDNA V3 區(qū) 的 引 物 341F （5′－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG－3′）和 534R （5′－ATTACCGCGGCTGCTGG－3′）對 提 取 的 DNA 進 行PCR擴增，PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。以Biorad Dcode系統(tǒng)對PCR產物進行DGGE分析，聚丙烯酰胺膠質量濃度為8%，變性劑濃度梯度為40%～60%。電泳完畢后，將膠置于含1mg·L－1EB的1×TAE緩沖溶液中染色，將染色后的凝膠用凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像。將待測序條帶切下，按前述PCR體系與條件進行擴增，送上海生工生物工程公司純化測序，測序結果輸入GenBank進行比對分析。

1．5 甲烷含量測定

用氣相色譜儀測定富集厭氧瓶頂空氣體中甲烷含量。進樣體積為0．5mL，采用面積歸一法定量。色譜條件如下：Al2O3色譜柱（50m×0．53mm×20μm）；柱溫從40℃開始，2min升至100℃，再以10℃·min－1的速率升至170℃，保持25min；進樣口溫度為100℃；FID檢測器溫度為150℃，載氣為高純氦氣。

1．6 含油量測定

用全自動紅外分光測油儀測定含油量。將《水質、石油類和動植物油的測定－紅外光度法》（GB／T 16488－1996）稍作改進。培養(yǎng)基中的原油經混合菌降解后變?yōu)槲⑿⌒躞w，萃取液通過鋪有無水Na2SO4的玻璃砂芯漏斗脫水時極易堵塞，因此采用循環(huán)水式真空泵將萃取液抽入抽濾瓶中。同時，為了保證脫水效果，將無水Na2SO4的厚度由標準中的10mm增至15 mm。

2 結果與討論

2．1 稠油降解產甲烷菌群的組成

勝利油田某區(qū)塊油井采出水在55℃下經過380d富集培養(yǎng)，獲得一組稠油降解產甲烷混合菌群，命名為SL－7。通過亨蓋特厭氧滾管技術從該菌群中分離獲得2株可分離培養(yǎng)單菌，分別記為SL－7－1、SL－7－2。分別提取混合菌群SL－7與2株單菌的DNA同時進行DGGE分析，比較單菌在混合菌群中的位置，結果見圖1。

圖1 混合菌群SL－7與單菌株的DGGE圖譜Fig．1 The DGGE analysis of the microbial consortium SL－7and two single strains

由圖1可知，混合菌群SL－7由6個主要的單菌株組成，并且2株降解單菌條帶均能與SL－7中的條帶相對應，SL－7－1對應Band 1，SL－7－2對應 Band 2。對主要條帶進行測序分析，確定了這些菌株的可能分類，結果見表2。

表2混合菌群SL－7DGGE條帶序列分析Tab．2 Sequence analysis of the microbial consortium SL－7from dominant DGGE bands

PCR－DGGE技術可以直觀地反映微生物的群落結構［15］，檢測到不易分離培養(yǎng)的優(yōu)勢菌株，揭示混合菌群的結構組成。由表2可知，混合菌群SL－7包含4株不可培養(yǎng)細菌（Band 3、Band 4、Band 5、Band 6）和2株已分離獲得的降解單菌（Band 1、Band 2）。單菌株SL－7－1與來自Firmiucutes（厚壁菌門）的Clostridium sp．XB90同源性為98%。研究表明，該類細菌能夠厭氧降解烴類化合物或者利用烴降解的中間產物產生甲烷菌可以利用的前體物質［16］。單菌株SL－7－2與來自β－Proteobacteria（β－變性菌門）的 Achromobacter sp．BPZ11同源性為97%。

SL－7對稠油的降解可能是微生物降解和其中多株單菌共同代謝、共同作用的結果。油田采出水中存在著經自然選擇優(yōu)化過的混合菌群，其中不同菌株的功能和作用通過長期的演化穩(wěn)定下來，在混合菌群SL－7中形成了一種較為穩(wěn)定的細菌群落結構，一些不可分離培養(yǎng)的菌株（如Band 3、Band 4、Band 5、Band 6所代表的菌株）可能對稠油的降解起著重要的作用，但在目前培養(yǎng)條件下無法分離得到。因此，直接利用混合菌群來降解稠油，可以避免這些無法分離培養(yǎng)的關鍵菌株的丟失［17］?；旌暇篠L－7將稠油中難以直接利用的大分子烴類降解為小分子烴類物質，完成稠油厭氧降解產甲烷的第一個階段，為下一步產氣階段做準備。

2．2 稠油降解產甲烷菌群的產甲烷特性

采用氣相色譜法測定富集厭氧瓶頂空氣體，以面積歸一法定量，結果如圖2所示。

由圖2可知，55℃下，混合菌群SL－7在380d的培養(yǎng)過程產生大量的甲烷氣體。培養(yǎng)30d時就有少量的甲烷氣體產生，隨著培養(yǎng)時間的延長，甲烷產生量逐漸增加，培養(yǎng)270d時甲烷產生量達到最大值，為1110μmol，之后甲烷產生量保持相對穩(wěn)定?；旌暇篠L－7的產甲烷規(guī)律與微生物的生長周期相關，符合其生長代謝規(guī)律。

圖2 混合菌群SL－7的產甲烷量Fig．2 Methane production of the microbial consortium SL－7

混合菌群SL－7培養(yǎng)270d所產混合氣的氣相色譜見圖3。

圖3 混合菌群SL－7培養(yǎng)270d所產混合氣Fig．3 Mixed gas produced by microbial consortium SL－7cultured for 270d

由圖3可知，混合菌群SL－7在富集培養(yǎng)270d后生成的有機氣體中，甲烷含量最高，占95．2%；檢測到的其它氣體有異丁烷、正戊烷、2，2－二甲基丁烷、2－甲基戊烷等，共占4．8%；此時混合菌群SL－7對稠油的降解率達到30．6%。

3 結論

（1）勝利油田某區(qū)塊油井采出水在55℃下經過380d富集培養(yǎng)獲得一組稠油降解產甲烷混合菌群SL－7，經過DGGE分析發(fā)現(xiàn)，該菌群由6株主要的單菌組成，其中2株單菌可分離培養(yǎng)，分別來自Firmiucutes（厚壁菌門）和β－Proteobacteria（β－變性菌門），另外4株單菌為不可分離培養(yǎng)的菌株。

（2）混合菌群SL－7經過270d培養(yǎng)，甲烷產生量達到最大值，為1110μmol；所產有機氣體中甲烷含量最高，占95．2%，其它氣體（異丁烷、正戊烷、2，2－二甲基丁烷、2－甲基戊烷等）占4．8%；此時混合菌群SL－7對稠油的降解率達到30．6%。

［1］孫煥泉．強基固本 開拓創(chuàng)新 確保油氣硬穩(wěn)定 再創(chuàng)開發(fā)新水平［J］．油氣地質與采收率，2007，4（2）：1－6．

［2］汪衛(wèi)東，王靜，耿雪麗，等．儲層殘余油生物氣化技術現(xiàn)狀與展望［J］．石油地質與工程，2012，26（1）：78－81．

［3］Zengler K，Richnow H H，Rossello M R，et al．Methane formation from long－chain alkanes by anaerobic microorganisms［J］．Nature，1999，401（6750）：266－269．

［4］Anderson R T，Lovley D R．Hexadecane decay by methanogenesis［J］．Nature，2000，404（13）：722－723．

［5］Jones D M，Head I M，Gray N D，et al．Crude－oil biodegradation via methanogenesis in subsurface petroleum reservoirs［J］．Nature，2008，451（7175）：176－180．

［6］Li H，Yang S Z，Mu B Z，et al．Molecular analysis of bacterial community structure in a continental high－temperature and waterflooded petroleum reservoir［J］．FEMS Microbiology Letters，2006，257（1）：92－98．

［7］Milkov A V．Secondary microbial origin of gas in giant cenomanian pools of western siberia［C］．Abstract for AAPG Annual Convention and Exhibition，Denver，Colorado，2009：7－10．

［8］包木太，牟伯中，王修林．采油微生物代謝產物分析［J］．油田化學，2002，19（2）：187－191．

［9］陳碩，李輝，楊世忠，等．PCR－DGGE用于檢測油田產出液中烴降解菌的多樣性［J］．微生物學雜志，2010，30（2）：1－6．

［10］Hendrickx B，Dejonghe W，F(xiàn)aber F，et al．PCR－DGGE Method to assess the diversity of BTEX mono－oxygenase genes at contaminated sites［J］．FEMS Microbiology Ecology，2006，55（2）：262－273．

［11］Hallmann C，Schwark L，Grice K．Community dynamics of anaerobic bacteria in deep petroleum reservoirs［J］．Nature Geoscience，2008，1（9）：588－591．

［12］Pham V D，Hnatow L L，Zhang S，et al．Characterizing microbial diversity in production water from an Alaskan mesothermic petroleum reservoir with two independent molecular methods［J］．Environmental Microbiology，2009，11（1）：176－187．

［13］Balch W E，Wolfe R S．New approach to the cultivation of methanogenic bacteria：2－Mercaptoethanesulfonic acid（HS－CoM）－dependent growth of Methanobacterium ruminantiumin a pressureized atmosphere［J］．Applied and Environmental Microbiology，1976，32（6）：781－791．

［14］李平蘭，張篪．利用亨蓋特厭氧滾管技術檢測雙歧桿菌制品中的活菌數(shù)［J］．食品科學，1999，20（2）：68－69．

［15］Muyzer G．DGGE／TGGE A method for identifying genes from natural ecosystems［J］．Current Opinion in Microbiology，1999，2（3）：317－322．

［16］Kunapuli U，Lueders T，Meekenstoek R U．The use of stable isotope probing to identify key iron－reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation［J］．The ISME Journal，2007，1（7）：643－653．

［17］李政，趙朝成，張云波，等．16種EPA－PAHs復合污染土壤的菌群修復［J］．中國石油大學學報（自然科學版），2012，36（1）：175－181．