豬瘟病毒E2蛋白抗原表位集中區(qū)的原核表達及鑒定

郭東光，朱艷平，銀 梅，寧紅梅，潘耀謙，劉 衛(wèi)，陳明艷，王選年，＊

（1.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng)453003）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起豬的一oprpaatcott種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，該病給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟損失［1］。CSFV基因組為12.3kb的單股正鏈線性RNA，包含一個開放性閱讀框架（ORF），編碼一個由3 898個氨基酸組成的多聚蛋白。此多聚蛋白經(jīng)病毒和宿主細胞酶的作用形成4個結(jié)構(gòu)蛋白（C、E0、E1、E2）和8個非結(jié)構(gòu)蛋白（p7、Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）［2］。其中結(jié)構(gòu)蛋白E0和E2是CSFV的兩個保護性抗原，兩者均能誘導(dǎo)產(chǎn)生豬瘟病毒的中和抗體，并使免疫豬抵抗致死劑量CSFV的攻擊［3］。目前公認CSFV囊膜蛋白E2是最主要的保護性抗原，含有CSFV高度保守的抗原決定簇［4］。

E2蛋白（Arg690Gly1062）分子質(zhì)量為51ku～55ku，是CSFV的主要跨膜結(jié)構(gòu)蛋白［5］。1989年Wensvoort G等［6］利用單抗競爭結(jié)合和抗原捕獲試驗對E2蛋白的抗原結(jié)構(gòu)分析，表明E2蛋白上存在4個抗原區(qū)，即A／D和B／C，并且這4個區(qū)均位于E2蛋白N端氨基酸殘基690～866之間，所以又稱之為抗原表位集中區(qū)。在E2蛋白的4個抗原區(qū)中，A1、B和C區(qū)域的抗原表位均可誘發(fā)動物的保護性免疫反應(yīng)，且B、C結(jié)構(gòu)域含有中和抗體的結(jié)合位點［7］。Zhou B等［8］利用原核表達系統(tǒng)表達了該抗原區(qū)兩個B細胞線性表位，rE-2a（CFRREKPFPHRMDCVTTTVENED，aa844～865）和rE2-b（CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT，aa693～716），免疫攻毒試驗表明均能產(chǎn)生很好的免疫保護力。Lin等通過缺失分析確定了E2蛋白上的一個線性表位TAVSPTTLR，其在E2蛋白上位于氨基酸殘基829～837個之間，并且這一序列在CSFV毒株中是極其保守，而在BVDV和BDV毒株中差異極大［9］。Liu等根據(jù)這一極度保守的線性B細胞表位設(shè)計了GST-M重組抗原，接種兔和豬均能產(chǎn)生有效的免疫保護［10］?？傊?，對CSFV E2蛋白抗原表位集中區(qū)的研究，已成為研制針對CSFV高效疫苗和快速血清學(xué)診斷試劑的主要對象。近年來關(guān)于用原核表達手段研究E2蛋白的文獻非常多，由于E2蛋白本身在C端有一段約30多個氨基酸組成的跨膜區(qū)（transmembrane region ，TMR）［11］，使其不利于在大腸埃希菌中得到表達，另一方面E2基因稀有密碼子含量較高，約占整個密碼子的25%～30%，使其更不利于在大腸埃希菌中得到高效表達，從而為CSFV抗體檢測時獲得重組抗原帶來一定困難。

本研究以E2蛋白的4個抗原區(qū)（A／D和B／C）為研究對象，設(shè)計引物擴增總長度為591bp，包含A／D和B／C整個抗原表位集中區(qū)，不僅避免了TMR對E2蛋白在原核表達系統(tǒng)中的影響，而且對上下游引物所包含的稀有密碼子進行偏嗜性修飾，改變?yōu)榇竽c埃希菌偏愛密碼子，使其有利于在大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)中得到高效表。然后通過構(gòu)建重組表達載體pET-30a-E2-1，轉(zhuǎn)化到Rostta（DE3）工程菌進行誘導(dǎo)表達，獲得具有抗原性的抗原表位集中區(qū)目的蛋白，經(jīng)BandScan5.0軟件分析，其表達量約占總菌體蛋白的46%，明顯提高了在原核表達系統(tǒng)中的表達水平，從而為CSFV抗體和抗原檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及工具酶 大腸埃希菌E.coli DH5α工程菌、Rostta（DE3）工程菌、pMD-18-E2（CSFV E2基因全長質(zhì)粒）均由河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存；pET-30a（＋）表達載體由河南科技學(xué)院病毒研究所提供；pMD18-T-simple載體、ExTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶，北京鼎國公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒，TIANGEN公司產(chǎn)品；ProteinPure-Ni-NTA Resin，北京全式金公司產(chǎn)品；兔抗豬瘟病毒C-株高免血清由河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，為北京索萊寶公司產(chǎn)品；AEC顯色試劑盒，為北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計及合成 據(jù)GenBank上CSFV C株序列（GenBank：AF531433.1）和pMD-18-E2基因全長質(zhì)粒，設(shè)計引物擴增CSFV E2A／D、B／C抗原表位集中區(qū)，擴增長度為591bp，上、下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ。引物由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成，其引物序列如下：F：5′-CG GAATTC CGC CTC GCC TGC AAG GAA GAT TAC CGC-3′（EcoRⅠ）；R：5′-CC CTCGAG TGT GTA GAC CAC TGG CTC GCC TTT CAC-3′（XhoⅠ）。

1.2.2 目的片段的擴增 以pMD-18-E2全長質(zhì)粒為模板，ExTaq DNA聚合酶進行E2抗原表位集中區(qū)基因片段的擴增。擴增體系為ExTaq buffer 5.0μL，dNTPs（2.5mmol／L）4.0μL，ExTaq DNA聚合酶1.0μL，F(xiàn) 1.0μL，R 1.0μL，pMD-18-E2 2.0μL，ddH2O 36.0μL，總體積50.0μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30 s，72℃60s，29個循環(huán)；72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定 將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T-simple vector，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選可疑菌落，經(jīng)鑒定正確后，命名為pMD18-T-simple-E2-1。雙酶切回收目的片段，于16℃水浴過夜連接至表達載體pET-30a（＋），命名為pET-30a-E2-1。連接體系如下：T4Ligation buffer 1.0μL，T4DNA 連接酶1.0μL，pET-30a（＋）酶切回收產(chǎn)物2.0μL，E2-1基因片段酶切回收產(chǎn)物6.0μL，總體積10.0μL。取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α工程菌后進行菌液PCR鑒定（檢測方法同1.2.2）。將PCR鑒定的陽性重組子進行雙酶切鑒定，其鑒定體系為10×buffer H 2.0μL，EcoRⅠ1.0μL，XhoⅠ1.0μL，pET-30a-E2 5.0μL，ddH2O 11.0μL，總體積20.0μL。混勻于37℃水浴中酶切2h。取適量酶切產(chǎn)物在10g／L瓊脂糖凝膠中檢測。

1.2.4 重組表達載體pET-30a-E2-1最佳誘導(dǎo)表達條件 將pET-30a-E 2--1經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Rostta（DE3）工程菌。挑取單菌落于37℃過夜培養(yǎng)作為種子液。取種子液按1∶100比例接種于新鮮的含Kan＋（100μg／mL）2×YT培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)至OD 600nm值為0.5～1.0，再加入IPTG至終濃度為1.0mmol／L，分別于37、28、18℃進行誘導(dǎo)6h，SDS-PAGE檢測。在確定的最佳誘導(dǎo)溫度下按上述方法重新誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，分別加入IPTG濃度為0.1、0.3、0.5、1.0mmol／L，誘導(dǎo)結(jié)束后SDS-PAGE檢測。

1.2.5 表達產(chǎn)物的可溶性分析 在1.2.4確定的最佳誘導(dǎo)表達條件下誘導(dǎo)200mL，收集菌體后超聲波裂解破碎菌體，分別收集沉淀和上清進行SDSPAGE檢測，確定目的蛋白的表達形式。

1.2.6 表達產(chǎn)物的Western blot鑒定 目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，切下需要轉(zhuǎn)膜部分，使用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀在電壓為25V條件下轉(zhuǎn)膜45min。結(jié)束后取出PVDF膜，TBST洗膜3次，用50g／L脫脂奶粉4℃封閉過夜；再用TBST洗膜3次，分別按1∶200和1∶2 000的比例加入兔抗CSFV高免血清和His單抗稀釋液于室溫反應(yīng)2h；TBST洗膜3次，分別按1∶1 000的比例加入HRP羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗于室溫反應(yīng)1h；TBST洗膜3次，AEC顯色試劑盒顯色，ddH2O沖洗終止顯色后觀察。

1.2.7 目的蛋白的純化 將超聲裂解得到的沉淀用含10g／L曲拉通的2mol／L尿素洗滌緩沖液洗滌3次，加入8mol／L尿素包涵體溶解液，4℃過夜溶解包涵體。將溶解的包涵體在4℃以10 000 r／min離心20min，裝進已處理好的His純化柱進行純化，SDS-PAGE檢測純化效果，并測定蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 CSFV E2-1基因的PCR擴增

取3μL PCR產(chǎn)物于10g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到一條與理論值大小相符的目的條帶，約591bp（圖1）。

圖1 E2-1基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of E2-1gene

2.2 重組表達載體pET-30a-E2-1的菌液PCR和雙酶切鑒鑒定

所挑菌落經(jīng)菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定，均在預(yù)期片段591bp處出現(xiàn)了目的條帶（圖2和圖3）。結(jié)果表明目的片段已正確插入到表達載體中，構(gòu)建了重組表達載體。

2.3 重組表達載體pET-30a-E2-1的最佳誘導(dǎo)表達檢測

將37℃、28℃、18℃誘導(dǎo)6h的樣品處理后，SDS-PAGE檢測，結(jié)果在18℃誘導(dǎo)條件下pET-30a-E2-1的表達量最高（圖4）。在18℃誘導(dǎo)的條件下用不同的IPTG濃度進行誘導(dǎo)6h，結(jié)果顯示PTG濃度對表達量的影響不大，為減少誘導(dǎo)時IPTG濃度過大對誘導(dǎo)菌的毒性作用，本研究選擇其最佳IPTG濃度為0.1mmol／L，并且所表達重組蛋白經(jīng)BandScan5.0軟件分析，其表達量約占總菌體蛋白的46%（圖4）。

圖2 重組表達質(zhì)粒pET-30a-E2-1的菌液PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the recombinant expression plasmid pET30-E2-1

圖3 重組表達質(zhì)粒pET-30a-E2-1的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant expression plasmid pET30-E2-1by EcoRⅠand XhoⅠdigestion

2.4 表達產(chǎn)物的Western blot鑒定

Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白均與CSFV C-株兔化高免血清（圖5）和His標(biāo)簽單抗（圖6）在31ku左右出現(xiàn)了特異性目的條帶。證明所表達的融合蛋白不僅能被特異性標(biāo)簽抗體識別，而且能被CSFV特異性血清抗體識別，具有良好的抗原性。

2.5 表達產(chǎn)物的可溶性分析及目的蛋白的純化

經(jīng)超聲裂解處理的樣品，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示沉淀含中有大量目的蛋白（圖7），說明目的蛋白的表達形式是包涵體。得到的包涵體經(jīng)純化處理后，獲得純較高的目的蛋白（圖7），其含量為1.4mg／mL。蛋白純化、洗脫的最佳咪唑濃度為100mmol／L。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

圖5 重組蛋白陽性血清的Western blot鑒定Fig.5 Western blot identification of recombinant proteins by positive serum

圖6 重組蛋白單克隆抗體的Western blot鑒定Fig.6 Western blot identification of recombinant proteins with Macb

圖7 純化重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified recombinant E2-1proteins by SDS-PAGE

3 討論

豬瘟一直以來危害著我國的養(yǎng)豬業(yè)，特別是溫和型和非典型CSF的發(fā)生普遍增加以及繼發(fā)感染或混合感染比較嚴(yán)重，給CSF的鑒別診斷帶來很大困難。而CSFV E2蛋白不管在CSFV的鑒別診斷還是抗體檢測方面都是最有價值的蛋白。傳統(tǒng)的CSFV抗體ELISA檢測方法都是以CSFV全毒為基礎(chǔ)進行檢測的，而純化CSFV全毒所采用的方法主要以蔗糖密度梯度離心法和氯化銫密度梯度離心法為主，由于這些方法在純化病毒時程序繁瑣、價格昂貴并且其成本較高，給臨床上CSFV的抗體檢測帶來困難［7-8］。為了克服這些缺點，我們利用原核表達手段獲得CSFV E2診斷抗原，最終獲得了其表達含量占菌體總蛋白的46%的重組目的蛋白。其成本低廉，容易純化，并能保持其良好的抗原性，為今后CSF的鑒別診斷和抗體檢測提供了很好的抗原。劉珂等［12］也用原核表達系統(tǒng)表達了該段蛋白，但其表達量僅占菌體總蛋白的20.1%。徐璐等［13］用分段表達的形式也表達了該段蛋白，雖然以可溶性形式表達，但其表達量只有15%～30%。所以，相比之下本研究更能為今后的CSFV抗體檢測提供充足的抗原。另外，我們的前期試驗數(shù)據(jù)顯示，重組蛋白純化后純度達到95%，Western blot鑒定呈陽性反應(yīng)，說明該蛋白具有很好的抗原性，同時也避免了在檢測CSFV抗體時因蛋白純度不高所出現(xiàn)的非特異性反應(yīng)。后期的動物試驗表明，用該蛋白免疫Balb／c小鼠，二次免疫后第10天以CSFV全毒1∶500倍包板檢測抗體水平，其效價能達到1∶800倍，說明該蛋白具有很好的免疫原性，同時也為CSFV單抗的制備奠定了基礎(chǔ)。

本研究高效表達了CSFV E2抗原表位集中區(qū)目的蛋白，雖然其表達形式為包涵體，但是表達量相對較高，且包涵體具有不易降解、易分離等特點，從而為CSFV抗原和抗體檢測試劑盒的研制打下了基礎(chǔ)。

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