豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗對小鼠初步免疫試驗

趙 德，李 鵬，2，高鳳山＊，馮 磊，許崇波

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.河北省涿鹿縣醫(yī)院，河北涿鹿075600）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染?。?-3］。從2010年以來，豬流行性腹瀉開始在全國流行，導(dǎo)致仔豬腹瀉，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失［4］。目前，傳統(tǒng)的豬流行性腹瀉疫苗已經(jīng)不能完全控制疫情的傳播和發(fā)生。在此情況下，研制新型的豬流行性腹瀉疫苗非常必要。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是一種易通過黏膜吸收的常在菌，適量的乳酸菌對維持腸道菌群平衡具有積極意義。NIZO公司近年來開發(fā)了乳酸乳球菌載體表達(dá)系統(tǒng)，在該載體上表達(dá)的外源基因很容易通過黏膜吸收；另外，該載體為食品級，不含有任何抗生素基因或其他有害成分［5-7］。利用該表達(dá)系統(tǒng)研制的疫苗，不僅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、無副作用的特點。

本研究以構(gòu)建的豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗為免疫原接種小鼠，測定其體重增長、抗體產(chǎn)生及IFN-γ產(chǎn)生等，為豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗在豬體的免疫試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡的SPF級雌性Balb／c小鼠30只，平均體重25g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8149及乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ3900購自荷蘭NIZO研究所。乳鏈菌肽（Nisin）購自Sigma公司，PEDV抗體ELISA檢測試劑盒由哈爾濱獸醫(yī)研究所馮力研究員課題組提供，小鼠IFN-γ購自凱基生物公司（南京），其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液的培養(yǎng) 豬流行性腹瀉病毒重組乳酸菌的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［8-9］進(jìn)行。將在-80℃保存的PEDV S基因保護(hù)性抗原基因片段C-COE重組乳酸菌接種到含有乳糖的 M17液體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)過夜。表達(dá)菌培養(yǎng)后，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組乳酸菌穩(wěn)定性的檢測 按照乳酸菌堿裂解法提取豬流行性腹瀉病毒重組乳酸菌質(zhì)粒，用SacⅠ和NcoⅠ雙酶切，以檢驗PEDV C-COE基因是否穩(wěn)定存在。同時將重組菌經(jīng)Nisin誘導(dǎo)，SDSPAGE檢測C-COE是否能正確表達(dá)。

1.2.3 免疫接種 將誘導(dǎo)后的PEDV重組乳酸菌在顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109個／mL，然后用滅菌的PBS進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋。試驗小鼠分為6組，每組5只，從A～F組分別為空白對照組、2倍稀釋口服組、5倍稀釋口服組、10倍稀釋口服組、10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組?？诜M每次每只小鼠空腹飲水6mL；間隔1周加強(qiáng)免疫，共免疫3次；注射組每只小鼠每次皮下注射0.2mL，間隔1周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫3次。

1.2.4 體重檢測 各組小鼠免疫前即第5周稱量1次，免疫后即第8周再稱量1次。比較各組小鼠體重增長情況。

1.2.5 PEDV特異性抗體檢測 最后一次免疫2周后對各組小鼠采血，分離血清，每組小鼠血清等比例混和，作為檢測樣品，然后用PEDV ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，比較各組小鼠產(chǎn)生PEDV特異性抗體情況，以衡量疫苗刺激產(chǎn)生的體液免疫情況。測定時，每個樣品3個重復(fù)。

1.2.6 血清IFN-γ的測定 同1.2.5采血分離血清，每組小鼠血清等比例混和后，按照Mouse IFN-γ ELISA kit操作說明檢測每組小鼠血清IFN-γ含量，以衡量乳酸菌疫苗細(xì)胞免疫的效果。每個樣品測定時進(jìn)行3個重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計學(xué)分析采用單側(cè)的t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PEDV重組乳酸菌穩(wěn)定性檢測

利用SacⅠ和NcoⅠ的雙酶切后，除載體帶（2 591bp）外，得到一條大約530bp的插入片段，與目的基因大小相符，說明目的基因在重組表達(dá)載體穩(wěn)定存在（圖1A）；SDS-PAGE電泳檢測顯示，目的基因在重組菌中成功表達(dá)，大小約為20ku，與預(yù)期的大小一致（圖1B）。

2.2 體重增長情況

圖1 PEDV重組乳酸菌質(zhì)粒穩(wěn)定性及表達(dá)鑒定Fig.1 Identification of stability and the expression of PEDV recombinant Lactococcus plasmid

免疫前后，共進(jìn)行了2次體重測定，結(jié)果顯示各組之間體重增長的差異不顯著，其中10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組平均體重略高于對照組和其他試驗組，但統(tǒng)計學(xué)顯示組間差異不顯著（P＞0.05）。其余對照組、2倍稀釋口服組和10倍稀釋口服組體重增長均等同于對照組（圖2）。

2.3 ELISA測定PEDV特異性抗體

口服組的PEDV抗體明顯的高于注射組，其中10倍稀釋口服組小鼠刺激產(chǎn)生的抗體水平最高，其次為2倍稀釋口服組。口服組小鼠的抗體水平均均顯著高于注射組（P＜0.05）（圖3）。

圖2 小鼠體重增長比較Fig.2 Comparison of weight gain among different groups of mice

圖3 ELISA檢測PEDV抗體Fig.3 Detection of PEDV antibodies by ELISA

2.4 小鼠IFN-γ測定結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各組小鼠血清中IFN-γ的含量，結(jié)果顯示5倍稀釋口服組和10倍稀釋口服組小鼠血清中IFN-γ整體水平不僅高于對照組，同時也高于注射組，與ELISA檢測PEDV特異性抗體試驗中的結(jié)果基本一致，而且，這4個試驗組小鼠血清中IFN-γ整體水平與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。2倍稀釋口服組的抗體含量較少，并低于對照組（圖4）。

3 討論

目前關(guān)于預(yù)防豬流行性腹瀉的疫苗還僅限于傳統(tǒng)的滅活疫苗，雖然對豬流行性腹瀉的傳播有一定的作用，但對于人類和動物而言，滅活疫苗中所含有的氫氧化鋁佐劑等都會對宿主細(xì)胞造成一定的損害。本研究在前期工作中構(gòu)建了PEDV乳酸菌疫苗，該疫苗采用乳酸乳球菌表達(dá)載體來裝載PEDV的免疫保護(hù)性抗原S（C-COE）基因，并轉(zhuǎn)化入缺失乳糖表達(dá)基因的乳酸乳球菌，構(gòu)建重組菌，該重組菌的篩選不需要抗生素，也不含有任何對宿主細(xì)胞有害的因素，屬于生物安全級的疫苗［10］。而且，乳酸菌能適應(yīng)腸道環(huán)境，是腸道內(nèi)的一種常在菌。乳酸菌易于通過腸道吸收，有利于產(chǎn)生黏膜免疫，這正好符合PEDV通過腸道感染并刺激產(chǎn)生黏膜免疫的特點［11-12］?？梢酝茰y，理論上通過口服這種疫苗產(chǎn)生的免疫效果要好于其他途徑，因此在試驗中我們設(shè)計了口服與注射兩種途徑。但作為口服疫苗，乳酸菌在腸道內(nèi)是否越多越好，是否會影響其他菌群的平衡，進(jìn)而影響動物的生長發(fā)育，也是本次試驗需要探討的問題。為此，在本試驗中，我們又設(shè)計了不同稀釋倍數(shù)的乳酸菌口服免疫小鼠，從生長發(fā)育及刺激產(chǎn)生的抗體等多個方面考察該乳酸菌疫苗的免疫效果。

圖4 小鼠血清中IFN-γ的含量測定Fig.4 Detection of the content of IFN-γ in sera of different groups of mice

通過測定免疫前后各組小鼠的體重，并比較各組小鼠的體重增長變化，發(fā)現(xiàn)各組間體重增長差異不顯著，對照組與2倍稀釋口服組、10倍稀釋口服組小鼠的平均體重增長一致，只是10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組小鼠的平均體重增略高于其他組，其原因目前不清楚，但組間差異不顯著。整體結(jié)果顯示，口服乳酸菌疫苗不會影響小鼠的生長發(fā)育。

免疫后，經(jīng)過ELISA檢測PEDV的特異性抗體，發(fā)現(xiàn)免疫組小鼠產(chǎn)生的PEDV抗體均顯著高于對照組（P＜0.05），而且口服組小鼠的抗體水平均高于注射組（P＜0.05），其中10倍稀釋口服組產(chǎn)生的抗體水平最高。該試驗結(jié)果說明，該PEDV乳酸菌載體疫苗確實能夠刺激產(chǎn)生PEDV特異性抗體，而且通過口服即黏膜吸收比注射即皮下吸收更容易產(chǎn)生高水平的抗體。因此，通過該試驗進(jìn)一步證實，乳酸菌載體疫苗確實更適宜于口服免疫，而且能夠刺激產(chǎn)生體液免疫。

本研究結(jié)果顯示，PEDV乳酸菌載體疫苗不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，而且還能刺激產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫另外，課題組嘗試了用PEDV強(qiáng)毒攻毒小鼠，檢測免疫保護(hù)率，但由于目前PEDV強(qiáng)毒對小鼠沒有致病性，所以無法測定免疫保護(hù)率。如果全面評價該疫苗的免疫保護(hù)率，下一步需要從本動物著手進(jìn)一步研究該疫苗的免疫效果。

以上試驗結(jié)果基本說明該PEDV乳酸菌載體疫苗能夠刺激模式動物小鼠產(chǎn)生PEDV特異性抗體，而且能產(chǎn)生一定程度的細(xì)胞免疫。相關(guān)的數(shù)據(jù)可以提供以豬作為試驗動物后，開展進(jìn)一步的臨床研究。

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