穩(wěn)定表達(dá)雞ST3GALⅠ基因BHK-21細(xì)胞株的建立

陳 歡，李明義，高 軒＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.山東信得科技股份有限公司，山東青島266101）

唾液酸（sialic acid）廣泛存在于各種生物組織中，是構(gòu)成細(xì)胞表面糖綴合物的組成成分，通常處于糖蛋白、糖脂和其他多糖的末端以糖苷的形式存在，攜帶負(fù)電荷，因而對(duì)于細(xì)胞與細(xì)胞之間的識(shí)別及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用有重要影響。流感病毒通過其表面的血凝素（HA）與宿主細(xì)胞表面唾液酸寡糖受體結(jié)合侵染宿主細(xì)胞。禽流感病毒傾向識(shí)別α-2，3連接型受體（NeuAcα-2，3-Gal），而人流感病毒傾向識(shí)別α-2，6連接型受體（NeuAcα-2，6-Gal）。β-半乳糖苷α-2，N-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（β-galactosideα-2，N-sialyltransferase，STNGal）屬于Ⅱ類膜蛋白，催化生成不同連接形式唾液酸的過程，這一過程產(chǎn)生唾液酸胞苷單磷酸酯（CMP-NeuAc），與各種寡糖結(jié)合從而組成多種糖蛋白、糖脂及多糖［1］，使唾液酸以不同連接形式存在于酸化的糖配體末端形成受體組分，在細(xì)胞與細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞分化及受體-配體聯(lián)接系統(tǒng)中扮演重要角色［2］。研究表明，禽流感病毒雖具備在MDCK、BHK-21等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制增殖能力，但由于受體豐度較低，造成病毒滴度低，形成蝕斑能力弱，給深入研究乃至疫苗和抗病毒藥物研制造成極大困難。本研究構(gòu)建了雞ST3GalⅠ 基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ，體外轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞株，建立穩(wěn)定表達(dá)ST3GaⅠ基因的BHK-21細(xì)胞系，通過穩(wěn)定表達(dá)ST3GALⅠ基因，增強(qiáng)ST3GalⅠ催化唾液酸與乳糖以α-2，3形式連接的效力，從而提高BHK-21細(xì)胞表面α-2，3連接型受體豐度，為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗提供備選細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒 pcDNA3.1-EGFP載體購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；pESG-T-ST3GalⅠ質(zhì)粒為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)徐守振老師饋贈(zèng)；E.coli DH5α和BHK-21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。Re-5（H5亞型禽流感病毒疫苗毒株）、H9亞型禽流感毒均來自山東信得動(dòng)物疫苗有限公司。

1.1.2 主要工具酶及試劑 Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XbaⅠ、Pyr obest DNA Polymerase、T4DNA連接酶均購(gòu)自Sigma公司；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA Marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；G418、DMEM 培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000Regeant購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)以下引物：ST3GAL-F：5′-ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC-3′；ST3GAL-R：5′-CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT3′。在起始密碼子 ATG前加入了利于真核表達(dá)的Kozak序列（斜體表示），在ORF兩端引入兩個(gè)酶切位點(diǎn)NotⅠ和XbaⅠ（下劃線表示）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以pESG-T-ST3GalⅠ質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增ST3GalⅠ基因。PCR條件：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GalⅠ的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)過8g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶用凝膠回收試劑盒回收，連接到pMD18-T載體上，將重組質(zhì)粒命名為pMD-ST3GalⅠ，經(jīng)過PCR及NotⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后用NotⅠ、XbaⅠ分別雙酶切pMD-ST3GaⅠ和pcDNA3.1-EGFP，酶切產(chǎn)物用8g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將目的條帶分別用凝膠回收試劑盒回收后，在T4DNA ligase的作用下16℃過夜。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定，命名為pcDNA3.1-EGFP-ST3GalⅠ。

1.2.2 BHK-21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 鑒定正確后按照Qiagen質(zhì)粒中提試劑盒操作說明制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ，鑒定正確、測(cè)定濃度后可用于轉(zhuǎn)染。BHK-21細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前1d接種于6孔板中（4×105細(xì)胞／孔），每孔3mL含80mL／L血清的DMEM培養(yǎng)液（無抗生素），培養(yǎng)18h～24h至80%細(xì)胞匯合。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFPST3GalⅠ及pcDNA3.1-EGFP空載體分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，按LipofectatimeTM 2000說明書操作。轉(zhuǎn)染24h后，開始換含G418的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定篩選。

1.2.3 抗性細(xì)胞克隆的篩選

1.2.3.1 G418篩選濃度的確定 BHK-21細(xì)胞接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板待長(zhǎng)至80%滿時(shí)加入G418使其濃 度 分 別 為 200、400、600、800、1 000、1 200 μg／mL，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，記錄細(xì)胞死亡情況。培養(yǎng)2周后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，選擇能在10d～14d把細(xì)胞全部殺死的濃度作為G418的篩選濃度。

1.2.3.2 G418篩選與陽性細(xì)胞克隆 待轉(zhuǎn)染24h后，換用含有G418（800mg／L）的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，2周后G418改為400mg／L維持劑量篩選，挑選抗性細(xì)胞集落，按有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆。1.2.4 抗性細(xì)胞克隆的鑒定

1.2.4.1 RT-PCR鑒定 提取轉(zhuǎn)染2周后細(xì)胞的基因組總RNA，用Oligo dT引物將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此cDNA模板，用引物ST3GAL-F和ST3GAL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃3 min；95℃1min，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4.2 熒光顯微鏡觀察 將轉(zhuǎn)染2周后且RTPCR鑒定陽性的細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 Re-5、H9亞型禽流感病毒在BHK-21-ST3GalⅠ細(xì)胞內(nèi)的增殖情況

1.2.5.1 不同病毒含量接種對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)病毒HA滴度的檢測(cè) 將長(zhǎng)成致密單層的BHK-21-ST3GalⅠ細(xì)胞以PBS洗滌3次后，按維持液體積的1%、2%、3%比例分別接種Re-5、H9亞型禽流感毒，吸附1h后，換無血清維持液，同時(shí)設(shè)空白BHK-21細(xì)胞接毒對(duì)照和陰性對(duì)照。8、16、24、48、60h時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。待80%細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落時(shí)收毒。凍融處理后用常規(guī)微量紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)病毒的HA滴度。

1.2.5.2 普通胰酶、TPCK-胰酶對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)病毒HA滴度的檢測(cè) 將長(zhǎng)成致密單層的BHK-21-ST3GalⅠ細(xì)胞按1%、2%、3%比例接種Re-5、H9亞型禽流感毒后，在細(xì)胞維持液中分別加入普通胰酶、TPCK-胰酶，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（無胰酶添加）。8、16、24、48、60h時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。待80%細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落時(shí)收毒。凍融處理后用常規(guī)微量紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)病毒的HA滴度。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ的構(gòu)建

陽性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增及NotⅠ和XbaⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1A）及酶切插入片段（圖1B）均約為1 029bp，與預(yù)期大小相符。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明插入載體pcDNA3.1-EG-FP-ST3GalⅠ中的ST3GalⅠ基因序列正確。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GalⅠ的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-EGFP-ST3GalⅠ

2.2 篩選培養(yǎng)基中G418濃度的選擇

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，G418濃度在700μg／mL～800μg／mL之間時(shí)，細(xì)胞于10d～14d全部死亡。故選擇800μg／mL為試驗(yàn)中BHK-21細(xì)胞的壓力篩選培養(yǎng)基中G418的濃度。

2.3 抗性細(xì)胞克隆的PCR和RT-PCR鑒定

提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR鑒定，連續(xù)傳6代均可獲得一條約1 029bp的特異性片段，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符（圖2），表明ST3GalⅠ基因已經(jīng)整合到BHK-21細(xì)胞基因組中。

2.4 抗性細(xì)胞克隆的熒光觀察

熒光顯微鏡下可見清晰的綠色熒光，表明eGFP表達(dá)，也間接表明目的基因ST3GAL1的表達(dá)成功。BHK-21-ST3GaLⅠ與正常BHK-21細(xì)胞未見明顯的形態(tài)差異（圖3）。持續(xù)傳代過程中使用無G418培養(yǎng)液培養(yǎng)仍可見綠色熒光的表達(dá)，同時(shí)在后續(xù)的RT-PCR鑒定過程中也使用的是無G418培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞，說明目的基因已整合進(jìn)BHK-21細(xì)胞基因組中并可持續(xù)表達(dá)。

圖2 抗性細(xì)胞的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of resistant cell clones by RT-PCR

圖3 抗性細(xì)胞克隆的熒光顯微鏡觀察結(jié)果（200×）Fig.3 Fluoroscope observation of resistant cell clones（200×）

2.5 Re-5、H9亞型禽流感毒在BHK-21-ST3GalⅠ細(xì)胞內(nèi)的增殖檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 不同病毒含量接種對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)病毒HA滴度的檢測(cè) 病毒的接毒量對(duì)Re-5、H9亞型禽流感毒在BHK-21-ST3GaLⅠ細(xì)胞上的增殖有一定影響，接毒量比較大會(huì)使細(xì)胞病變加快，接毒量太低，病毒在細(xì)胞里的增殖又不夠，Re-5、H9亞型禽流感毒按2%接毒量接種后，病毒在BHK-21-ST3GaLⅠ細(xì)胞中增殖HA滴度最高（表1、表2）。

2.5.2 普通胰酶、TPCK-胰酶對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)流感HA滴度影響的檢測(cè) 維持液中胰酶的濃度對(duì)流感病毒的HA有顯著影響。胰酶濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫落，濃度過低又會(huì)影響到病毒的HA（表3、表4）。

表1 接種病毒含量對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)Re-5流感病毒HA滴度影響Table 1 Effects of inoculated virus contents on Re-5influenza virus HA titers in cell culture

表2 接種病毒含量對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)H9亞型禽流感病毒HA滴度影響Table 2 Effects of inoculated virus contentson H9influenza virus HA titers in cell culture

表3 普通胰酶和TPCK-胰酶對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)Re-5流感病毒HA滴度影響Table 3 Effects of normal pancreatic enzyme and TPCK-pancreatic enzyme on Re-5influenza virus HA titers in cell culture

表4 普通胰酶和TPCK-胰酶對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)H9亞型禽流感病毒HA滴度影響Table 4 Effects of normal pancreatic enzymes and TPCK-pancreatic enzyme on H9influenza virus HA titers in cell culture

3 討論

真核表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP含有巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子序列及SV40加尾信號(hào)和終止序列，還帶有新霉素抗性基因neo及綠色熒光蛋白基因eGFP，便于用G418抗性及綠色熒光蛋白標(biāo)記雙重篩選，可以在多種細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源基因［3］。將雞ST3GALⅠ基因的開放閱讀框序列cDNA克隆至pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建了pcDNA3.1-EGFP-ST3GaLⅠ表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定表達(dá)ST3GALⅠ基因的BHK-21細(xì)胞系。對(duì)構(gòu)建好的BHK-21-ST3GalⅠ細(xì)胞系進(jìn)行了RTPCR鑒定，同時(shí)在無G418壓力篩選下持續(xù)傳代細(xì)胞株，結(jié)果顯示外源基因仍可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)至少10代以上。說明在所得單克隆細(xì)胞株中，ST3GaLⅠ基因開放閱讀框序列cDNA已整合進(jìn)入BHK-21細(xì)胞基因組中，能夠隨著BHK-21細(xì)胞傳代而穩(wěn)定持續(xù)地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。使用RT-PCR和熒光顯微鏡對(duì)BHK-ST3GaLⅠ細(xì)胞系與BHK細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，也證實(shí)了ST3GALⅠ基因在BHK-21中獲得了穩(wěn)定表達(dá)。

同時(shí)我們還做了Re-5、H9亞型禽流感毒在BHK-21-ST3GaLⅠ細(xì)胞內(nèi)的增殖檢測(cè)，病毒的接毒量對(duì)禽流感病毒在細(xì)胞中的增殖也有一定影響，接毒量過大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞病變過快，病毒滴度不高；接毒量太低，病毒在細(xì)胞中的增殖又不夠，同樣影響病毒滴度。胰酶對(duì)禽流感病毒在細(xì)胞上的增殖也有一定影響，TPCK-胰酶可使不具感染性的非裂解型血凝素變?yōu)榫吒腥拘缘难?，從而促進(jìn)病毒在細(xì)胞中的繁殖［4］。普通胰酶對(duì)細(xì)胞損傷很大，細(xì)胞易脫落，造成HA滴度偏低。維持液中添加適量的TPCK-胰酶，可實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞中進(jìn)行有效多循環(huán)復(fù)制，從而獲得較大的病毒滴度；而且胰酶能補(bǔ)充細(xì)胞中蛋白酶，增加了血凝素的裂解量，增強(qiáng)流感病毒感染力［5］。結(jié)果表明，BHK-21-ST3GaLⅠ細(xì)胞在接毒量為2%時(shí)HA滴度達(dá)到1∶256，顯著高于空白BHK-21細(xì)胞組?？瞻譈HK-21細(xì)胞添加TPCK-胰酶組的HA滴度顯著高于不添加TPCK-胰酶組的HA滴度，BHK-21-ST3GaLⅠ細(xì)胞組HA滴度受胰酶影響不明顯。H5N1和H9N2亞型禽流感病毒在BHK-21-ST3GaLⅠ細(xì)胞間可多循環(huán)感染，病毒滴度逐漸升高。

目前，流感疫苗主要的生產(chǎn)介質(zhì)是雞胚，雞胚源疫苗存在著質(zhì)量難以控制、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、易引起過敏等問題［6-7］，因此急需開發(fā)新的流感疫苗生產(chǎn)介質(zhì)。細(xì)胞是生產(chǎn)疫苗的優(yōu)良介質(zhì)，已有報(bào)道利用Vero細(xì)胞和MDCK細(xì)胞生產(chǎn)制備人用流感疫苗［8-9］。細(xì)胞受體和流感病毒HA受體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)是決定流感病毒宿主特異性的主要因素。禽流感病毒HA優(yōu)先結(jié)合SAα-2，3-GAL受體［10］，而人流感病毒則優(yōu)先結(jié)合SAα-2，6-GAL［11］受體。盡管α-2，3與α-2，6連接型受體都在MDCK和Vero細(xì)胞表面表達(dá)，但豐度并不高，導(dǎo)致流感病毒在這些細(xì)胞中增殖的滴度低，限制了其使用。由此，必須從細(xì)胞和流感病毒兩個(gè)方面著手，使其相互適應(yīng)并繁殖擴(kuò)增，以達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的可能。流感病毒和受體結(jié)合是實(shí)施感染的關(guān)鍵步驟，也影響到流感病毒在細(xì)胞中復(fù)制的效率。提高細(xì)胞表面病毒受體水平，可顯著提高病毒復(fù)制的效率。對(duì)于流感病毒受體的研究更多的集中在人流感病毒2，6連接型受體，已建成提高α-2，6連接型受體表達(dá)量的MDCK細(xì)胞系以提高對(duì)人流感病毒的敏感性，而對(duì)禽流感病毒2，3連接型受體研究較少。曹文雁等［3］將雞ST3GaLⅠ基因整合進(jìn)MDCK細(xì)胞構(gòu)建成穩(wěn)定表達(dá)ST3GALⅠ基因的MDCK細(xì)胞系MDCK-ST3GaLⅠ細(xì)胞系，通過穩(wěn)定表達(dá)ST3GALⅠ基因，增強(qiáng)ST3GaLⅠ催化唾液酸與乳糖以α-2，3形式連接的效力，提高了細(xì)胞表面NeuAcα-2，3-GaL受體豐度，顯著改進(jìn)了部分H5N1和H9N2亞型分離株在MDCK細(xì)胞系上的感染敏感性和復(fù)制能力。

本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)雞ST3GAL基因的BHK-21細(xì)胞株，不但能穩(wěn)定表達(dá)ST3GALⅠ基因，從而提高2，3連接型受體豐度，更適于禽流感病毒的生長(zhǎng)；而且利用BHK-21細(xì)胞可懸浮培養(yǎng)特性，可實(shí)現(xiàn)流感病毒在BHK-21中高效復(fù)制，為BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)高滴度流感病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。此外，對(duì)于禽流感病毒受體結(jié)合特性變異株監(jiān)測(cè)、抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測(cè)定也具有應(yīng)用價(jià)值。

［1］ Paulson J C，Colley K J.Glycosyltransferases［J］.J Biol Chem，1989，264（30）：17615-17618.

［2］ Keawcharoen J，Oraveerakul K，Kuiken T，et al.Avian influenza H5N1in tigers and leopards［J］.Emerg Infect Dis，2004 10（12）：2189-2191.

［3］ 曹文雁.穩(wěn)定表達(dá)雞ST3GalⅠ的 MDCK細(xì)胞系的建立［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

［4］ Hughes M T，McGregor M，Suzuki T，et al.Adaptation of influenza A viruses to cells expressing low levels of sialic acid leads to loss of neuraminidase activity［J］.J Virol，2001，75（8）：3367-3370.

［5］ 羅鳳山，齊念民.封閉連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒工藝過程關(guān)鍵技術(shù)的研究［D］.上海：上海交通大學(xué)，2008.

［6］ Oxford J S，Newman R，Corcoran T，et al.Direct isolation in eggs of influenza A（H1N1）and B viruses with haemagglutinins of different antigenic and amino acid composition［J］.J Gen Virol，1991，72（1）：185-189.

［7］ Rocha E P，Xu X，Hall H E，et al.Comparison of 10influenza A （H1N1and H3N2）haemagglutinin sequences obtained directly from clinical specimens to those of MDCK cell-and egg-grown viruses［J］.J Gen Virol，1993，74 （11）：2513-2518.

［8］ Hoffmann E，Krauss S，Perez D，et al.Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines［J］.Vaccine，2002，20（25）：3165-3170.

［9］ Kistner O，Howard M K，Spruth M，et al.Cell culture（Vero）derived whole virus（H5N1）vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses［J］.Vaccine，2007，25（32）：6028-6036.

［10］ 馮 新，宋戰(zhàn)昀，韓文瑜，等.新城疫病毒受體在不同動(dòng)物細(xì)胞上的分布比較［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（9）：1145-1150.

［11］ Glaser L，Conenello G，Paulson J，et al.Effective replication of human influenza viruses in mice lacking a major alpha 2，6 sialyltransferase［J］.Virus Res，2007，126（1）：9-18.