氟苯尼考與鹽酸多西環(huán)素體外聯(lián)合抑菌效果研究

王樂樂，鄒 明，張啟迪，鄒本革，李曉飛，畢可東＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽265200；3.招遠(yuǎn)市張星獸醫(yī)站宋家分站，山東招遠(yuǎn)265405）

氟苯尼考為美國先靈-葆雅（Schering-Plough）公司研制的獸用廣譜抗菌藥，為新一代氯霉素類獸用合成抗菌劑，具有抗菌譜廣、體內(nèi)分布廣等特點(diǎn)［1］。氟苯尼考對(duì)許多氯霉素耐藥菌株敏感［2］，對(duì)人畜均安全，且在組織中殘留較低［3］，自上世紀(jì)90年代陸續(xù)在日本、歐美及中國等上市，主要用于防治牛、豬及水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性感染［4-6］。多西環(huán)素為獸藥臨床常用抗菌藥物，具有抗菌譜廣、吸收迅速、生物利用度高、有效藥物濃度維持時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，且在抗菌機(jī)理方面與氟苯尼考有互補(bǔ)作用。本試驗(yàn)通過應(yīng)用氟苯尼考與多西環(huán)素復(fù)方制劑對(duì)人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病的療效觀察，為合理使用該藥治療雞大腸桿菌病提供科學(xué)依據(jù)。

多西環(huán)素抗菌譜基本等同于土霉素。同其他四環(huán)素類抗生素一樣，多西環(huán)素亦具有廣譜抑菌作用［7］，敏感菌包括肺炎球菌、鏈球菌、部分葡萄球菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、棒狀桿菌等革蘭陽性菌以及大腸埃希菌、巴氏桿菌、沙門菌、布魯菌、嗜血桿菌、克雷伯菌和鼻疽桿菌等革蘭陰性菌。對(duì)支原體（如豬肺炎支原體）、衣原體、立克次體、螺旋體等也有一定程度的抑制作用。獸醫(yī)臨床上多西環(huán)素常用于防治巴氏桿菌病、布魯菌病、炭疽及大腸埃希菌和沙門菌感染、急性呼吸道感染、馬鼻疽、馬腺疫和豬支原體肺炎等［7］。尤適用于腎功能減退患畜。

目前，國內(nèi)外對(duì)該藥單獨(dú)使用的藥動(dòng)學(xué)［8-12］和藥效學(xué)［13-19］的研究較多，對(duì)于兩藥的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)則研究的相對(duì)較少。

因?yàn)榉侥峥嫉膹V泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的耐藥情況日益嚴(yán)重，因此復(fù)方氟苯尼考的開發(fā)應(yīng)用，成為目前的一個(gè)熱點(diǎn)。氟苯尼考受自身特點(diǎn)限制，與其他藥物聯(lián)用存在諸多局限性，主要需要注意的有：①氟苯尼考與大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類及泰妙菌素聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生拮抗作用。②不可與β-內(nèi)酰胺類及氟喹諾酮類聯(lián)用。氟苯尼考是細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的速效抑菌劑，而β-內(nèi)酰胺類及氟喹諾酮類藥物屬于繁殖期速效殺菌劑。在氟苯尼考作用下，細(xì)菌因蛋白質(zhì)合成被抑制而停止生長(zhǎng)繁殖，從而減弱后者的殺菌作用。③不能與磺胺嘧啶鈉混合后一起肌注?？诜蚣∽⒔o藥時(shí)忌與堿性藥物合用，以免分解失效［20］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C83903（O141∶K85，K88ab）；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29213）；豬霍亂沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 13312）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

金黃色葡萄球菌，沙門菌，大腸埃希菌分離株為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)分離并保存。

1.1.2 藥品與主要試劑 氟苯尼考粉（含量98%，20090624），石家莊瑞田生化有限公司生產(chǎn)；鹽酸多西環(huán)素（含量99.4%，批號(hào)090703），營養(yǎng)肉湯，MH營養(yǎng)瓊脂。

rTaqDNA 聚合酶、dNTP、DL-2000 Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；BCM-100型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ZDX-35I型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；AR2140電子分析天平，Chaussure Corp.Pine Brook，NJ，USA產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550），島津Shimadzu產(chǎn)品；可調(diào)微量移液器，Eppendorf產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分子生物學(xué)PCR鑒定 根據(jù)沙門菌invA基 因（STY3019）、金黃色葡萄球菌nuc 基 因（SAR0847）［21］和腸毒素性大腸埃希菌（ETEC）K88菌毛基因［22］，采用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.1.1 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增

1.2.1.1.1 菌株的培養(yǎng)及DNA 提取 將待檢的3種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別活化，在平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落用液體LB 培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，取2 mL 以10 000r／min離心3min去上清液，在加入100μL去離子水，混合均勻，100℃煮沸5 min，12 000 r／min離心5min取上清保存于-20℃作為模板備用。

1.2.1.1.2 PCR檢測(cè) PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，rTaq酶0.5μL，模板量3μL，引物1μL＋1μL，滅菌超純水15μL，總體積25μL，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 循環(huán)參數(shù)：94℃5min；94℃30s、58℃30s、72℃45s，30 個(gè)循環(huán)；72℃7min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.2.1.2 檢測(cè)保存的菌株 選取實(shí)驗(yàn)室保存的金黃色葡萄球菌，沙門菌，大腸埃希菌臨床分離株各20株，按以上的方法進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.2 體外抑菌試驗(yàn) 經(jīng)分離鑒定豬的大腸埃希菌、沙門菌，大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C83903（O141∶K85，K88ab）；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29213）；豬霍亂沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 13312），質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922（均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

采用棋盤法［23］進(jìn)行試驗(yàn)，相同過程重復(fù)3 次。試驗(yàn)結(jié)果以部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)［24］。

1.2.2.1 藥液的配制 用分析天平精確稱取鹽酸多西環(huán)素128.0 mg（稱取量按照有效成分含量計(jì)算），置于50mL棕色容量瓶中，用滅菌的蒸餾水制備成濃度為2 560μg／mL 溶液，定容并使其完全溶解，備用。

取紫外分光光度計(jì)測(cè)定氟苯尼考含量為2 560 μg／mL的氟苯尼考-2-HPBCD包合液備用。

1.2.2.2 單藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用常量肉湯稀釋法，操作均于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。對(duì)已經(jīng)鑒定完畢的陽性菌株重新編號(hào)。取各細(xì)菌對(duì)數(shù)期菌液，用0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁艹C正菌液濃度至1×108cfu／mL，在將各菌液稀釋至1×107cfu／mL；對(duì)兩藥物儲(chǔ)備液進(jìn)行倍比稀釋使藥物濃度為2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5μg／mL備用。

取0.1 mL 的1×107cfu／mL 菌液于0.9 mL MH 肉湯培養(yǎng)基中，再加入1mL 藥物，此時(shí)每管中細(xì)菌終濃度為5×105cfu／mL，藥物濃度分別為1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg／mL。

3個(gè)重復(fù)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h～24 h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2.3 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用肉湯稀釋棋盤法測(cè)定（3個(gè)重復(fù)）鹽酸多西環(huán)素與氟苯尼考-2-羥丙基-β-環(huán)糊精聯(lián)合用藥的體外抗菌活性，以各藥對(duì)應(yīng)的MIC值的2 倍、1 倍、1／2 倍、1／4 倍、1／8 倍等濃度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h～24h。

試驗(yàn)結(jié)果以部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)的數(shù)值作為聯(lián)合用藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果的判斷依據(jù)：FIC≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1為相加作用；1＜FIC≤2為無關(guān)作用；FIC＞2為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果

3種標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR 擴(kuò)增獲得條帶均與目的條帶大小一致，可以用其引物作PCR檢測(cè)（圖1）。

對(duì)臨床分離的保存于實(shí)驗(yàn)室的17株疑似沙門菌、20株疑似金黃色葡萄球菌、17株疑似大腸埃希分別進(jìn)行PCR鑒定，其中沙門菌11株（圖2），金黃色葡萄球菌16株（圖3），大腸埃希菌13株為陽性（圖4）。

2.2 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單藥及聯(lián)合用藥試驗(yàn)結(jié)果 鹽酸多西環(huán)素對(duì)各臨床菌株的MIC為10μg／mL ～80μg／mL；氟苯尼考對(duì)各臨床菌株的MIC為320～40μg／mL（表2～表5）。

鹽酸多西環(huán)素對(duì)豬霍亂沙門菌ATCC 13312標(biāo)準(zhǔn)菌株，大腸埃希菌ATCC 8739標(biāo)準(zhǔn)菌株，金黃色葡萄球菌ATCC 29213標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC為20、20、10μg／mL（表2～表5）。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定Fig.1 Identification of PCR products

圖2 沙門菌臨床株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR products of the clinical strains of Salmonella

圖3 金黃色葡萄球菌臨床株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR products of the clinical strains of Staphyloccocus aureus

圖4 大腸埃希菌臨床株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR products of the clinical strains of Escherichia coli

氟苯尼考-2-HPBCD 對(duì)豬霍亂沙門菌ATCC 13312標(biāo)準(zhǔn)菌株，大腸埃希菌ATCC 8739 標(biāo)準(zhǔn)菌株，金黃色葡萄球菌ATCC 29213 的MIC 為80、80、20μg／mL（表2～表5）。

氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素對(duì)臨床株菌的FIC指數(shù)為0.75～2。有3株金黃色葡萄球菌、1株大腸埃希菌表現(xiàn)為無關(guān)作用，其余菌株均為相加作用；質(zhì)控菌株中金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株為無關(guān)作用，其他兩株質(zhì)控菌株為相加作用（表2～表5）。

2.2.2 藥物比例選擇結(jié)果 結(jié)果見表6。由表6結(jié)果可知，氟苯尼考與鹽酸多西環(huán)素一1∶2的比例聯(lián)合應(yīng)用是用量小，效果好。

表2 兩種藥物對(duì)沙門菌的MICTable 2 MIC of 2medicines to Salmonella

表3 兩種藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MICTable 3 MIC of 2medicines to Staphyloccocus aureus

表4 兩種藥物對(duì)大腸埃希菌的MICTable 4 MIC of 2medicines to Escherichia coli

表5 兩種藥物對(duì)質(zhì)控菌株的MICTable 5 MIC of 2medicines to ACTC

表6 藥物比例選擇Table 6 Drug proportion selection

3 討論

3.1 單藥抑菌試驗(yàn)

單一藥物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：兩種藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的MIC值較小，說明藥物本身的抑菌作用確實(shí)，這與苑麗［25］報(bào)道類似。但大腸埃希菌和沙門菌臨床株的MIC值比其標(biāo)準(zhǔn)株高數(shù)倍，這可能是由于臨床菌株對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。鹽酸多西環(huán)素單藥MIC的試驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)不同G-菌的抑菌作用表現(xiàn)也有所不同，這與胡功政等［26］報(bào)道的一致。這可能與目前獸醫(yī)臨床抗菌藥應(yīng)用時(shí)間長(zhǎng)且不合理，從而使細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生了較高度的耐藥有關(guān)。

3.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

苑麗等［27］采用棋盤法進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，選擇氟苯尼考分別與恩諾沙星、TMP、多西環(huán)素聯(lián)合用藥，恩諾沙星明顯不能與氟苯尼考聯(lián)用，而氟苯尼考與TMP及多西環(huán)素聯(lián)用對(duì)大腸埃希菌都有良好的體外抑菌效果。胡功政等［26］也發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)用對(duì)大腸埃希菌、鏈球菌具有良好抑菌作用。吳亮等發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考分別與大黃、黃連、黃芩、黃柏聯(lián)用時(shí)，針對(duì)不同的菌株可呈現(xiàn)出協(xié)同作用。事實(shí)上，目前已確定與氟苯尼考配伍具有協(xié)同作用的僅有TMP 與多西環(huán)素，目前對(duì)于氟苯尼考的復(fù)方的開發(fā)與研制的報(bào)道較少。

試驗(yàn)結(jié)果表明，氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素聯(lián)用時(shí)，MIC值比單用時(shí)減小了1／2，表明兩種藥物在聯(lián)用時(shí)能明顯地降低藥物濃度；并且聯(lián)合用藥時(shí)FIC值在0.5～1.0之間，呈現(xiàn)相加作用，這與江麗［28］所報(bào)道的類似。

氟苯尼考在細(xì)菌病防治上的研究應(yīng)用逐漸增多，但由于價(jià)格高、用量大，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，氟苯尼考與鹽酸多西環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)基本呈現(xiàn)相加作用，在相同抑菌效果下能明顯減少藥物的用量；在棋盤法中，可以看出當(dāng)氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素以1∶2的比例聯(lián)合使用時(shí)效果最佳，能夠明顯減少氟苯尼考的用量，從而在保證藥效的前提下降低成本，有利于氟苯尼考的推廣應(yīng)用。

由此可見，氟苯尼考與鹽酸多西環(huán)素聯(lián)用在獸醫(yī)臨床疾病治療方面具有一定的意義，可擴(kuò)大抗菌譜同時(shí)減少給藥劑量，并能保證有效防治動(dòng)物混合或繼發(fā)感染。因此，通過合理的制劑研制技術(shù)，將兩藥物按照比例制成復(fù)方制劑，將會(huì)對(duì)獸醫(yī)臨床疾病的治療起到良好的作用，應(yīng)用前景廣闊。

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