補(bǔ)料培養(yǎng)在豬鏈球菌疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

付 強(qiáng)，程立坤，苗立中，何軍柱，沈志強(qiáng)，，韓文瑜

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

在發(fā)酵工業(yè)中，為了提高產(chǎn)量，補(bǔ)料-分批培養(yǎng)（fed-batch culture）在食品和醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛［1］，其優(yōu)勢(shì)在于可以解除底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)。

在豬敗血性鏈球菌活疫苗的發(fā)酵培養(yǎng)研究方面，采用分批培養(yǎng)方式［2］，菌數(shù)一般60億左右，超時(shí)培養(yǎng)活菌數(shù)明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)主要代謝副產(chǎn)物乳酸明顯抑制后期菌數(shù)的提高［3］。本試驗(yàn)采用補(bǔ)料-分批培養(yǎng)策略，設(shè)計(jì)恒速流加和溶氧反饋兩種培養(yǎng)模式，以分批培養(yǎng)為對(duì)照，考察在不同培養(yǎng)條件下乳酸含量的變化和活菌數(shù)穩(wěn)定性以及最終凍干率的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬鏈球菌弱毒ST171 株，由山東綠都生物科技有限公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備 GUJS-10C 型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程有限公司產(chǎn)品；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SBA-40C型乳酸葡萄糖分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 改良緩沖肉湯，按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程2000版》制備。500g／L 葡萄糖溶液，116℃滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將凍干菌種ST171加適量滅菌馬丁肉湯溶解后，接種至一個(gè)鮮血馬丁瓊脂平板上37℃培養(yǎng)22h。選取光滑、黏稠、圓形露珠狀菌落若干混合傳代一個(gè)鮮血馬丁瓊脂平板，37℃培養(yǎng)22h。

1.2.2 種子培養(yǎng) 用緩沖肉湯培養(yǎng)基洗下馬丁瓊脂平板上的菌落，分別接種于100mL 緩沖肉湯中，并加入20mL／L豬血清，搖勻，置37℃恒溫培養(yǎng)8h后冷藏保存。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.3.1 分批培養(yǎng)模式 將培養(yǎng)8h的種子液按20mL／L接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)添加20 mL／L豬血清和20g／L 葡萄糖溶液，37℃培養(yǎng)，初始攪拌轉(zhuǎn)速100r／min，通過(guò)自動(dòng)流加4 mol／L NaOH 溶液控制pH 在7.4，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量保持溶氧在30%～50%，每隔1h按照無(wú)菌操作取樣檢測(cè)殘?zhí)?、乳酸和吸光度變化，?duì)6、7、8h的樣品做活菌計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 恒速流加培養(yǎng)模式 將培養(yǎng)8h的種子液按20mL／L接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，初始攪拌轉(zhuǎn)速100r／min，從培養(yǎng)后3h開始流加500g／L葡萄糖，流速16mL／h，在溶氧上升時(shí)流速增加為37mL／h，共培養(yǎng)8h結(jié)束，通過(guò)自動(dòng)流加4mol／L NaOH 溶液控制pH 在7.4，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量保持溶氧在30%～50%，每隔1h按照無(wú)菌操作取樣檢測(cè)殘?zhí)恰⑷樗岷臀舛茸兓?，?duì)6、7、8 h的樣品做活菌計(jì)數(shù)。

1.2.3.3 溶氧反饋流加培養(yǎng)模式 將培養(yǎng)8h的種子液按20 mL／L 接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，初始攪拌轉(zhuǎn)速100r／min，在溶氧升高至80%時(shí)流加適量葡萄糖溶液，保持溶氧在30%～80%，通過(guò)自動(dòng)流加4 mol／L NaOH 溶液控制pH在7.4，每隔1h按照無(wú)菌操作取樣檢測(cè)殘?zhí)?、乳酸和吸光度變化，?duì)6、7、8h的樣品做活菌計(jì)數(shù)。

1.2.4 凍干 將明膠蔗糖保護(hù)劑按1∶7的比例加入收獲的菌液，混勻，將菌液分裝小瓶，立即凍干。凍干曲線：0℃～5℃進(jìn)箱，以每分鐘1℃降至-40℃，維持約4h，板層控制在-10℃，維持14h～16 h，每間隔2h升溫10℃，在28℃維持6h出箱，全程約30h。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 菌體濃度 以吸光度表示，取發(fā)酵液稀釋10倍，在600nm 下測(cè)定吸光度，記為OD 600。

1.2.5.2 發(fā)酵液活菌計(jì)數(shù) 按《活菌計(jì)數(shù)SOP》進(jìn)行，計(jì)算菌落形成單位（cfu）。

1.2.5.3 殘?zhí)?、乳酸含量檢測(cè) 用乳酸葡萄糖分析儀檢測(cè)。

1.2.5.4 凍干苗活菌數(shù)檢驗(yàn) 按《活菌計(jì)數(shù)SOP》進(jìn)行，計(jì)算菌落形成單位（cfu）。

2 結(jié)果

2.1 三種培養(yǎng)方式下殘?zhí)羌案碑a(chǎn)物乳酸含量對(duì)比

三種培養(yǎng)方式下殘?zhí)羌案碑a(chǎn)物乳酸含量對(duì)比結(jié)果如圖1和圖2所示。

采取恒速流加和溶氧反饋流加補(bǔ)糖措施，與分批培養(yǎng)相對(duì)照，減少乳酸含量的優(yōu)勢(shì)不明顯，均為近“S”型曲線上升，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳酸含量也同時(shí)大幅增加。這與高海軍，等人在獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的研究結(jié)論一致，即乳酸和菌體生長(zhǎng)在發(fā)酵方式下都是徹底偶聯(lián)的［4］。

分批培養(yǎng)模式，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可以分為三個(gè)階段，0～2h為延滯期，此段時(shí)間菌體生長(zhǎng)和葡萄糖消耗以及乳酸生成均緩慢；菌體在2h～7h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵液中菌體濃度（OD值）迅速增加（圖3），與此同時(shí)，葡萄糖消耗迅速，乳酸含量也同時(shí)大幅增加，在培養(yǎng)7h時(shí)殘?zhí)菨舛冉咏悖樗嵘闪窟M(jìn)入穩(wěn)定期，菌體OD值達(dá)到最大值，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入一個(gè)短暫的穩(wěn)定期；7h 后迅速進(jìn)入衰亡期，OD值及活菌數(shù)（圖3、圖4）均開始下降。

恒速流加培養(yǎng)模式，在流加的前2h 耗糖速率小于補(bǔ)糖速率，殘?zhí)菨舛仍黾?，在流加培養(yǎng)的2h后耗糖速率逐漸大于補(bǔ)糖速率，殘?zhí)菨舛戎饾u降低，在流加后4h溶氧迅速上升，菌體減緩生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，說(shuō)明培養(yǎng)體系缺少碳源葡萄糖，故在此時(shí)增加流加速率，保持溶氧為一定范圍（30%～50%）。殘?zhí)菣z測(cè)葡萄糖濃度約在0.2g／L～1.0g／L，說(shuō)明鏈球菌糖代謝很旺盛，流加的葡萄糖迅速被消耗。

DO-Stat培養(yǎng)模式，在前期通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量保持溶氧穩(wěn)定在一定范圍（30%～50%），大約3h后溶氧迅速上升至80%，此時(shí)開始補(bǔ)糖，每次補(bǔ)糖量約為培養(yǎng)體積的0.1%（V／V），溶氧在30%～80%范圍內(nèi)波動(dòng)。通過(guò)每次取樣檢測(cè)結(jié)果看，殘?zhí)菨舛冉咏?，說(shuō)明補(bǔ)加的葡萄糖被迅速消耗，細(xì)菌在培養(yǎng)體系中處于缺糖狀態(tài)。

圖1 殘?zhí)呛侩S培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 The dynamics of concentration of residual glucose and culture time

圖2 乳酸含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.2 The dynamics of accumulation of lactic acid and culture time

2.2 三種培養(yǎng)方式菌液吸光度、活菌數(shù)對(duì)比

三種培養(yǎng)方式菌液吸光度、活菌數(shù)對(duì)比結(jié)果如圖3、4所示。

從圖3可以看出，在培養(yǎng)3h后，發(fā)酵液中菌體濃度（OD值）迅速增加，在7h 后除恒速流加方式菌體OD值保持上升外，其它培養(yǎng)方式OD值變化明顯減緩甚至降低。

從圖4可看出恒速流加培養(yǎng)方式，其培養(yǎng)后期活菌數(shù)緩慢上升，其他培養(yǎng)方式在7h～8h后活菌數(shù)迅速降低，其中溶氧反饋培養(yǎng)方法，后期菌體量均低于分批和恒速流加培養(yǎng)方式。

圖3 吸光度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.3 The dynamics of optical density and culture time

圖4 活菌數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.4 The dynamics of viable bacterial counts and culture time

通過(guò)比較，恒速流加培養(yǎng)方式有較長(zhǎng)的穩(wěn)定期，在培養(yǎng)的6h～8h內(nèi)活菌數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，在實(shí)際生產(chǎn)中何時(shí)放料有較長(zhǎng)時(shí)間的選擇期。

2.3 三種培養(yǎng)方式不同培養(yǎng)時(shí)間凍干率對(duì)比

三種培養(yǎng)方式不同培養(yǎng)時(shí)間凍干率對(duì)比結(jié)果見圖5。

從圖5可看出，三種培養(yǎng)方式，在培養(yǎng)6h時(shí)凍干率最高（大于70%），隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，凍干率均有不同程度的下降，說(shuō)明培養(yǎng)后期的菌體不適合凍干環(huán)境。試驗(yàn)結(jié)果表明在培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期及時(shí)凍干有助于保持較高的凍干率。

3 討論

3.1 乳酸代謝

本試驗(yàn)條件下通過(guò)對(duì)比豬敗血性鏈球菌活疫苗的不同培養(yǎng)方式，得出補(bǔ)料培養(yǎng)模式并不能有效杜絕代謝副產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生，在菌體生長(zhǎng)的同時(shí)乳酸必然產(chǎn)生，即菌體生長(zhǎng)與乳酸代謝相偶聯(lián)，在培養(yǎng)的后期糖代謝依舊非常旺盛，但絕大部分轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，菌體生長(zhǎng)減緩甚至停止。

圖5 培養(yǎng)方式對(duì)凍干率的影響Fig.5 Effect of culture methods on lyophilized rate

恒速流加和溶氧反饋培養(yǎng)方法，作為發(fā)酵培養(yǎng)中常用的前饋和反饋控制模式可以比較有效地減少眾多代謝副產(chǎn)物的生成，在食品、基因工程菌方面廣泛應(yīng)用［5-6］。本試驗(yàn)中三種培養(yǎng)策略乳酸生成量均為“S”型曲線，與菌體OD 600變化曲線基本一致，其原因可能為許多產(chǎn)莢膜鏈球菌的TCA 循環(huán)不完全［7］，屬于發(fā)酵型代謝，且代謝途徑比較單一，其能量的產(chǎn)生主要來(lái)自糖酵解途徑（EMP），大部分的碳源都被轉(zhuǎn)變成了乳酸，只有約5%～10%的碳源被用來(lái)合成細(xì)胞物質(zhì)［8］。

3.2 活菌數(shù)及凍干

冷凍干燥是凍干劑型生物制品生產(chǎn)的最后一道工序，凍干后菌數(shù)直接影響其最終的頭份數(shù)，要求最大限度的保持菌體活性，必須選擇最佳的培養(yǎng)時(shí)間及時(shí)收獲、凍干，以保證頭份數(shù)。

分批培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單易行，但培養(yǎng)后期活菌數(shù)變化大，并且在實(shí)際生產(chǎn)中重復(fù)性差，培養(yǎng)終止時(shí)間很難準(zhǔn)確定性，造成培養(yǎng)后活菌數(shù)和凍干后活菌數(shù)批次間差異較大。

溶氧反饋培養(yǎng)方法活菌數(shù)及凍干率偏低，原因可能在于一方面反饋式調(diào)節(jié)有一定的滯后性，該過(guò)程溶氧反饋階段造成菌體頻繁處于“營(yíng)養(yǎng)饑餓”狀態(tài)，葡萄糖濃度過(guò)低限制了菌體生長(zhǎng)［9］，而添加糖液時(shí)又會(huì)瞬時(shí)局部營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，并不十分有利于最大量地增殖細(xì)胞和完全抑制代謝副產(chǎn)物的生成。另一方面從代謝調(diào)控的角度看，升高的溶氧也可能產(chǎn)生氧自由基，對(duì)菌體有毒害作用［10］。

通過(guò)比較，恒速流加培養(yǎng)方式，能有效延長(zhǎng)活菌數(shù)穩(wěn)定期，提高凍干率，可能與在培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)的流加葡萄糖，碳源保持在比較適宜的濃度有關(guān)［11］，其操作方式相對(duì)于指數(shù)流加簡(jiǎn)單易行，在培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期及時(shí)凍干有助于保持較高的凍干率，有利于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)車間的工藝優(yōu)化。生物制品在冷凍干燥中，還要考慮其他因素，如：起始細(xì)胞液的濃度、冷凍干燥保護(hù)劑、再水化劑等，本試驗(yàn)僅從菌體的生長(zhǎng)情況方面考察對(duì)凍干率的影響，以求保持較高的凍存菌數(shù)。

鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化研究多集中在食品科學(xué)方面，如乳酸菌的培養(yǎng)［12］、透明質(zhì)酸的生產(chǎn)［13］等，在疫苗類鏈球菌的生產(chǎn)研究方面報(bào)道不多，張毓金采用后期補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)菌數(shù)達(dá)到2.65×109cfu／mL［14］，本試驗(yàn)條件下活菌數(shù)提高了2倍且菌數(shù)穩(wěn)定期延長(zhǎng)，凍干率達(dá)到80%，為工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)一步優(yōu)化提供了有益的參考和借鑒。

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