辣椒花藥培養(yǎng)影響因素的研究

龔明霞 ，何鐵光 ，2，董文斌 ，趙坤 ，王益奎 ，王日升 ，康德賢

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧，530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所）

辣椒（Capsicum annuum L.）是一種重要的蔬菜作物和調(diào)味品，在中國(guó)種植面積已超過(guò)130萬(wàn)hm2，位列世界之首。花藥培養(yǎng)是人工產(chǎn)生單倍體的關(guān)鍵技術(shù)，通過(guò)花藥培養(yǎng)單倍體途徑加速親本純系的選育，提高親本優(yōu)異基因的聚合是目前辣椒育種的重要途徑之一。辣椒花藥培養(yǎng)研究開(kāi)始較早[1，2]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從培養(yǎng)基[3]、小孢子發(fā)育時(shí)期[5]、活性炭[6]、溫光培養(yǎng)條件[7]等方面做過(guò)研究?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)雖有許多優(yōu)勢(shì)，但目前辣椒花藥培養(yǎng)還有大量的具體問(wèn)題需要探索，如辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體的誘導(dǎo)效果隨基因型的不同而存在很大差異，在實(shí)際應(yīng)用中，需要對(duì)有價(jià)值的不同基因型的辣椒材料進(jìn)行研究，以提高辣椒單倍體的誘導(dǎo)效率。本研究以不同果型和不同基因型的優(yōu)良辣椒雜交F1代、優(yōu)良辣椒品系花藥為材料，研究其胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)及繼代生長(zhǎng)的影響因素，以提高不同果型辣椒花藥培養(yǎng)的出胚率、出愈率和愈傷組織的質(zhì)量，推動(dòng)這幾個(gè)優(yōu)良辣椒品系的花藥培養(yǎng)在辣椒育種方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料有雜交種F1代植株花藥，分別為Fk（M）×Fk（F）、Fk（F）×Fk（M）、1-8-3×1-8-8、HX-1×TW-1，另外2個(gè)基因型材料為1個(gè)不育系A(chǔ)和1個(gè)保持系B（A、B均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供）。

1.2 試驗(yàn)方法

①材料種植和采樣方法 2010年8月中旬浸種催芽，在塑料育苗盤(pán)中育苗，9月中旬移栽辣椒苗定植于大棚中，11月下旬開(kāi)始采樣。采集萼瓣一致，長(zhǎng)約3 mm的幼蕾，每株選取2～3個(gè)，采下后裝入自封口塑料袋，隨即放入裝有冰塊的泡沫箱中，然后帶回實(shí)驗(yàn)室，放入4℃的冰箱進(jìn)行低溫預(yù)處理7 d。

②接種方法 接種當(dāng)天，從冰箱中拿出花蕾材料，在室溫中放置約1 h。然后于超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精浸泡消毒約30 s后，用無(wú)菌水清洗1次，再用加有2～3滴吐溫-80的0.1%HgCl2溶液浸泡消毒8～9 min，每2 min晃動(dòng)一次使之與消毒液充分接觸，最后用無(wú)菌水浸洗4～5次，傾倒無(wú)菌水，用鑷子夾出，放在無(wú)菌濾紙上吸干水分后，剝出花藥，接種至培養(yǎng)基上。

③培養(yǎng)方法 接種完畢后，將培養(yǎng)瓶放置培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)溫度為30℃，再?gòu)呐囵B(yǎng)箱中取出置光暗交替條件下培養(yǎng)，16 h光照/8 h黑暗，溫度為（28±1）℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

接種 15 d后統(tǒng)計(jì)并剔除有污染的花藥培養(yǎng)瓶，期間觀察和記錄愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)狀況，接種40 d后統(tǒng)計(jì)辣椒花藥褐化數(shù)、胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)情況，并計(jì)算花藥污染率、褐化率及愈傷組織誘導(dǎo)率。

計(jì)算公式如下：污染率（%）=（污染花藥數(shù)/接種花藥總數(shù)）×100%；褐化率（%）=（花藥褐化數(shù)/無(wú)污染花藥總數(shù)）×100%；出胚率（%）=（誘導(dǎo)出胚狀體的花藥數(shù)/無(wú)污染花數(shù)總數(shù)）×100%；愈傷組織誘導(dǎo)率 （%）=（愈傷組織發(fā)生數(shù)/無(wú)污染花藥總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型辣椒花蕾的消毒效果比較

將不同基因型的辣椒花蕾用同一種方法進(jìn)行消毒處理，接種后的部分花藥在2～3 d后污染，但因基因型的不同受污染的情況有差異（表1）。6個(gè)辣椒品種中有一半未受污染，其中2個(gè)品種的污染率較低，最高的污染率為23.08%，這說(shuō)明采用此消毒方法效果較好。另外說(shuō)明在秋冬季采取辣椒的花蕾比較容易消毒。

2.2 基因型對(duì)辣椒花藥愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)的影響

表1 不同基因型辣椒花藥消毒效果比較

表2 基因型對(duì)辣椒花藥愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)的影響

將辣椒的花藥接種至培養(yǎng)基10 d后，大部分花藥在培養(yǎng)基上呈黃白色或黃綠色，沒(méi)有發(fā)生褐變，且能夠膨大生長(zhǎng)，只有少數(shù)花藥完全變成黑褐色死亡狀；接種35 d后有些品種有很少量的胚狀體形成；接種40 d后，大部分膨大生長(zhǎng)的花藥都能夠形成白色愈傷組織，大部分的愈傷組織質(zhì)地致密，表面有毛狀物，少數(shù)較疏松，個(gè)別松散為顆粒透明狀，而有些花藥既沒(méi)有形成愈傷組織，也不分化出胚狀體，只是膨大生長(zhǎng)，花藥表面呈綠色。從表2中可以看出，不同果型的辣椒花藥培養(yǎng)時(shí)胚狀體的誘導(dǎo)率不同，大果型的 Fk（M）×Fk（F）和 Fk（F）×Fk（M）雜交的F1代植株花藥胚狀體誘導(dǎo)率最高，為1.38%，小果型的HX-1×TW-1雜交的F1代植株花藥不能誘導(dǎo)出胚狀體；辣椒花藥出愈率因基因型不同而有差異，F(xiàn)k（M）×Fk（F）的 F1代植株花藥出愈率最高，比最低的高51.79個(gè)百分點(diǎn)；不同基因型辣椒花藥的死亡率不同，最高的死亡率為40.00%，比最低的高31.67個(gè)百分點(diǎn)。

2.3 接種量對(duì)辣椒花藥出胚率和出愈率的影響

研究了每瓶接種的花藥數(shù)量對(duì)胚狀體和愈傷組織形成的影響。結(jié)果表明（表3），培養(yǎng)瓶中花藥接種量越大，出愈率越高，死亡率越低，但出胚率差異不明顯。如對(duì)于HX-1×TW-1的F1代植株花藥，每瓶接種2個(gè)花蕾的花藥比1個(gè)的出愈率高13.24個(gè)百分點(diǎn)，但對(duì)于其他4個(gè)品種來(lái)說(shuō)，接種量導(dǎo)致的出愈率變幅為0.77～24.19個(gè)百分點(diǎn)，可見(jiàn)接種量對(duì)辣椒花藥愈傷形成的影響因品種而異。另一方面，接種量不同所引起的花藥死亡率變幅為2.79～13.32個(gè)百分點(diǎn)，這種差異因品種而異，如對(duì)于HX-1×TW-1的F1代植株花藥來(lái)說(shuō)，接種量增大后死亡率降低了13.32個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 基因型和接種量對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

為了探明辣椒花藥愈傷組織在繼代培養(yǎng)過(guò)程中能否繼續(xù)分化出胚狀體，研究了基因型和接種量對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響。轉(zhuǎn)接40 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒花藥愈傷組織在繼代培養(yǎng)中容易變褐并逐漸死亡。從表4可知，每瓶接種量對(duì)辣椒花藥愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響因品種而異，有的表現(xiàn)出接種量多成活率高，如 Fk（F）×Fk（M）的 F1代植株的花藥愈傷，接種量為每瓶10塊的比6塊的成活率高20.91個(gè)百分點(diǎn)；有些表現(xiàn)出接種量少成活率高，如不育系A(chǔ)植株的花藥愈傷，每瓶接種6塊的比10塊的成活率高26.28個(gè)百分點(diǎn)。但所有成活的愈傷組織繼代培養(yǎng)1次，均不能夠分化出胚狀體，說(shuō)明從愈傷組織中分化出胚狀體比較困難。

3 小結(jié)與討論

辣椒花藥培養(yǎng)首先要對(duì)花蕾表面進(jìn)行消毒，試驗(yàn)中由于消毒不嚴(yán)格，有時(shí)材料會(huì)全部受到污染，所以材料消毒是關(guān)系到花藥培養(yǎng)成敗的第一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。本試驗(yàn)所采用的辣椒花蕾消毒方法效果較好，一半材料未受到污染。這不僅與材料的預(yù)處理有關(guān)，還與材料的選擇及消毒技術(shù)有關(guān)。

供體植株基因型是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。本研究表明，辣椒花藥胚狀體誘導(dǎo)受基因型和果型的影響較大，這與前人的研究結(jié)果一致[8，9]。陳曉等[6]的研究中，43個(gè)辣椒供體基因型中胚狀體誘導(dǎo)率為0～18%。Mitykó等[10]報(bào)道，辣椒基因型不同誘導(dǎo)率不同，最高可達(dá)到178.2%，最低只有1.0%，小果和和中果基因型的花粉植株誘導(dǎo)率較低或?yàn)?。Dolcet-Sanjuan等[11]的研究結(jié)果表明，隨辣椒果型逐漸變小，孤雄生殖的誘導(dǎo)能力逐漸降低。

表3 接種量對(duì)辣椒花藥出愈率和出胚率的影響

表4 基因型和接種量對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

辣椒花藥培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率差異大。本研究從6份基因型中篩選出3份適合花藥培養(yǎng)的基因型；但胚狀體誘導(dǎo)率均較低，與所報(bào)道的較高的誘導(dǎo)率懸殊很大[10]，后繼工作中尚需從培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，以提高出胚率。有學(xué)者認(rèn)為辣椒植株小孢子雄核發(fā)生能力依賴于不同基因型的遺傳特異性可能與B型花粉粒的比例有關(guān)，B型花粉粒是具有雄性發(fā)育潛力的花粉，活體內(nèi)B型花粉粒的頻率在不同品種的不同花藥間有差異，與花藥愈傷組織的誘導(dǎo)和植株的再生密切相關(guān)[12]，因此，需從分子生物學(xué)角度深入探討辣椒花藥培養(yǎng)中雄核發(fā)育和胚狀體形成的發(fā)育機(jī)理。

關(guān)于花藥接種密度的問(wèn)題研究較少，本研究結(jié)果表明，接種密度影響辣椒花藥出愈率，但對(duì)出胚率幾乎無(wú)影響。這一結(jié)果與李春玲等[13]的研究結(jié)果不同，即增加花藥在培養(yǎng)基上的接種密度，能明顯提高甜椒胚狀體的誘導(dǎo)頻率。另外，本試驗(yàn)中辣椒花藥培養(yǎng)易形成愈傷組織，但這些初代形成的愈傷組織在繼代培養(yǎng)中易褐化死亡，而且均不能在繼續(xù)培養(yǎng)的第一代中分化出胚狀體，對(duì)其是否在以后的多代培養(yǎng)中分化出胚狀體或不定芽還有待進(jìn)一步研究。

[1]郭仲琛，李春玲，蔣中仁.甜椒花藥培養(yǎng)的初步研究[J].園藝學(xué)報(bào)，1980，7（1）：34-38.

[2]George L,Narayanaswamy S.HaploidCapsicumthrough experimental androgenesis[J].Protoplasma,1973,78:467-470.

[3]Yoon Y J,Lee K S,Chang S K.Plant induction by anther culture of hot pepper(Capsicum annuumL.)[J].Journal of the Korean Society for Horticultural Science,1991,32:8-16.

[4]趙激，鄒學(xué)校，張竹青，等.不同培養(yǎng)基對(duì)辣椒花藥培養(yǎng)的影響 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，36（2）：181-185.

[5]Mitykó J,Fári M.Problems and results of doubled haploid plant production in pepper (Capsicum annuumL.)via anther and microspore culture[J].Acta Hort,2001,122:281-287.

[6]陳曉，詹玉絲，徐小利，等.花藥培養(yǎng)建立辣椒 DH純系的初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（9）：52-55.

[7]劉廣霞，張曉偉，蔣武生，等.溫度及培養(yǎng)基中添加物對(duì)辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)的影響 [J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：97-100.

[8]張馨宇，王永成，劉愛(ài)群，等.辣椒花藥培養(yǎng)研究新進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（8）：331-334.

[9]楊博智，周書(shū)棟，張竹青，等.不同培養(yǎng)基和激素對(duì)辣椒花藥培養(yǎng)的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，35（1）:61-64.

[10]Mitykó J,Andrásfalvy A,Csilléry G,et al.Anther culture response in different genotypes and F1hybrids of pepper(Capsicum annuumL.)[J].Plant Breeding,1995,114:78-80.

[11]Dolcet-Sanjuan R,Claveria E,Huerta A.Androgenesis in Capsicum annuumL.——Effects of carbohydrate and carbon dioxide enrichment[J].J Amer Soc Hort Sci,1997,122(4):468-475.

[12]黃璐，衛(wèi)志明.不同基因型玉米的再生能力和胚性與非胚性愈傷組織 DNA的差異[J].植物生理學(xué)報(bào)，1999，25（4）：333-338.

[13]李春玲，蔣仲仁.對(duì)甜椒花藥培養(yǎng)中一些影響因素的研究[J].中國(guó)蔬菜，1983（2）：35-37.