UPLC-MS/MS分析橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的變化趨勢(shì)

江 海，李新生,*，吳三橋，張志健，劉 新，韓 豪，高 玥，彭 浩，胥彥明

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；3.陜西城固酒業(yè)有限公司，陜西 城固 723200)

柑橘是世界第一大水果，世界柑橘常年總產(chǎn)量6000～10000萬(wàn)t。分布于全球140個(gè)國(guó)家和地區(qū)，其中柑橘產(chǎn)量居世界前3位的分別為巴西、美國(guó)、中國(guó)[1-3]。我國(guó)柑橘經(jīng)濟(jì)栽培區(qū)主要集中在北緯20～33°之間，海拔700～1000m以下的亞熱帶、熱帶地區(qū)，年栽培面積133～200萬(wàn)公頃之間，占世界栽培面積的20%，其中長(zhǎng)江上中游柑橘帶、贛南-湘南-桂北柑橘帶、浙南-閩西-粵東柑橘帶為我國(guó)柑橘優(yōu)勢(shì)栽培區(qū)[4]。2007年，我國(guó)柑橘種值面積和產(chǎn)量均居世界首位[5]，主要包括日南1號(hào)、宮川、山下紅、大浦、興津等100多個(gè)品中。其中寬皮橘類(lèi)占80%以上，多集中于11—12月上市。世界柑橘加工率約為40%，主要加工產(chǎn)品年產(chǎn)量大約為1860×104t，分別為柑橘汁、橘瓣罐頭，以及柑橘糖制品果醬、果凍和蜜餞[6-7]。而我國(guó)柑橘的加工率不足10%，鮮食量超過(guò)90%。

隨著柑橘栽培面積的擴(kuò)大，加之品種結(jié)構(gòu)不合理，柑橘上市集中，國(guó)內(nèi)缺乏大型柑橘加工企業(yè)等原因，目前國(guó)內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)常常出現(xiàn)“豐產(chǎn)不豐收”，柑橘滯銷(xiāo)，橘農(nóng)“賣(mài)橘難”等問(wèn)題，嚴(yán)重挫傷了橘農(nóng)種植積極性，在個(gè)別地方甚至出現(xiàn)了橘農(nóng)砍伐果樹(shù)的現(xiàn)象。解決我國(guó)柑橘滯銷(xiāo)問(wèn)題，最可行的辦法就是大力發(fā)展柑橘深加工。

鑒于此，本項(xiàng)目組開(kāi)展了利用柑橘果汁發(fā)酵生產(chǎn)柑橘果酒的生產(chǎn)技術(shù)研究，但是，在柑橘果酒發(fā)酵過(guò)程中，橘子汁發(fā)酵液會(huì)出現(xiàn)極明顯的苦味，這成為了困擾柑橘果酒生產(chǎn)的難題。柑橘發(fā)酵中苦味主要來(lái)自檸檬苦素類(lèi)(limonins)的作用。檸檬苦素是一種三萜類(lèi)的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于柑橘屬植物中，至今已從柑橘屬植物中分離出36種檸檬苦素類(lèi)似物及17種檸檬苦素類(lèi)似物配糖體[8-9]。據(jù)報(bào)道，檸檬苦素在水溶液中的苦味閾值約為1×10-6mol/L。有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素和諾米林酸，如果在柑橘果汁中的含量超過(guò)6mg/L，那么這種柑橘就不適合用于飲食業(yè)[10-13]。

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)對(duì)柑橘果酒發(fā)酵工藝中橘汁發(fā)酵液檸檬苦素進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，分析橘子發(fā)酵加工產(chǎn)品中苦味變化趨勢(shì)，旨為柑橘果酒研制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢中主產(chǎn)柑橘品種宮川，經(jīng)剝皮、榨汁、橘汁調(diào)節(jié)糖度后于發(fā)酵罐中發(fā)酵，取不同發(fā)酵階段和陳釀階段的液體為檢測(cè)材料[14-15]。

乙腈(色譜純) 美國(guó)Burdick and Jackson 公司；娃哈哈純凈水；甲醇(分析純) 天津市登峰化學(xué)試劑廠；檸檬苦素(純度為99.8%) 天津一方科技有限公司。

1.2 材料與儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜、ACQUITY TQD三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TD24-低速臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀器有限公司；AUW220D電子天平(十萬(wàn)分之一)、AUY220電子天平(萬(wàn)分之一) 日本島津公司；SK1200H超聲波清洗機(jī) 無(wú)錫市興邦基業(yè)電子有限公司；BM252C榨汁機(jī) 美的公司；全自動(dòng)生物發(fā)酵罐(7L) 上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50mm×2.5mm，1.9μm)，柱溫40℃，流速0.3mL/min，進(jìn)樣5μL。流動(dòng)相為：乙腈-水(A：B)梯度洗脫，乙腈(A)梯度為0～3min(10%～50%)，3～4min(50%～10%)，4～5min(10%～10%)。

1.3.2 質(zhì)譜條件

毛細(xì)管電壓3.2kV，錐孔電壓40kV，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度400℃，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氣流量800L/h。離子化模式為電噴霧離子源正離子模式(electrospray ionization，ESI+)，碰撞池電壓30V，碰撞氬氣流速0.14mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)，檸檬苦素母離子m/z 471.1，子離子m/z 425.3、161.1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

用AUW220D電子天平，精密稱(chēng)取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品2.85mg，用10mL乙腈溶解，超純水定容至25.0mL。制得檸檬苦素114mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照母液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mL，用50%乙腈溶液定容于10mL容量瓶。得到含檸檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在儀器設(shè)定的色譜-質(zhì)譜條件下，通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品各5μL，以檸檬苦素母離子m/z 471.1進(jìn)行選擇，m/z 425.3為定性離子，m/z 161.1為定量離子。

1.3.5 定量限實(shí)驗(yàn)

將含檸檬苦素0.57μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)谝合噘|(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析，以RSN=10確定檸檬苦素和諾米林檢測(cè)的定量限。

1.3.6 樣品的制備

取3批橘子汁樣品各5L(總糖70.9g/L，總酸9.26g/L)做平行實(shí)驗(yàn)，調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度到218g/L，引入葡萄酒酵母，21℃條件下在發(fā)酵罐中主發(fā)酵7d，主發(fā)酵結(jié)束后酒精度(V/V)為12.5%～13.5%(20℃)，后導(dǎo)入陶罐中進(jìn)行陳釀。

取主發(fā)酵時(shí)間為0、2、4、5、6、7d的發(fā)酵液和陳釀15、30、60、90、180d和360d的基酒進(jìn)行分析檢測(cè)。

精密量取5.0mL橘汁發(fā)酵液于50.0mL具塞三角燒瓶中，加5.0mL乙腈，稱(chēng)定燒瓶質(zhì)量。超聲處理30min，稱(chēng)量燒瓶質(zhì)量，用乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量。4000r/min離心3min，取上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素線(xiàn)性的繪制

圖 1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin standard

標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖1，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。檸檬苦素線(xiàn)性回歸方程為：Y=62.7883X+11.245，r=0.99954。該檢測(cè)條件下，檸檬苦素在2.85～114ng之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 定量限確定

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，在液相-質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析得到RSN=10，計(jì)算得檸檬苦素的定量檢測(cè)限為2.8ng/mL。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一橘汁發(fā)酵液，按1.3.6節(jié)方法制備樣品，在色譜-質(zhì)譜條件下平行測(cè)定5次，每次進(jìn)樣5μL，測(cè)定檸檬苦素的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中檸檬苦素的峰面積分別為432.1、448.2、428.5、439.8、437.6，RSD為1.73%(n=5)，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一橘汁發(fā)酵液，在色譜-質(zhì)譜條件下，分別在0.5、1、6、12、24h進(jìn)樣5μL檢測(cè)檸檬苦素的峰面積，分別為428.7、432.2、425.6、411.8、410.6，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，求得RSD為2.36%(n=5)。結(jié)果表明在該方法條件下，檸檬苦素24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已測(cè)定檸檬苦素為12.46mg/L的橘汁發(fā)酵液5.0mL，加入5.7mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.3.6節(jié)方法制備樣品條件平行制備3份，在色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定，計(jì)算檸檬苦素的回收率，結(jié)果如表1所示。

表 1 回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Recovery rate of the UPLC- MS/MS method

2.6 橘子汁發(fā)酵液中檸檬苦素含量

表 2 橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的質(zhì)量濃度Table 2 Limonin concentration in fermented orange juice

圖 2 橘汁發(fā)酵液檸檬苦素色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin in fermented orange juice

橘汁發(fā)酵4d后液體中的檸檬苦素的色譜圖見(jiàn)圖2，平行制備3個(gè)批次的橘子汁發(fā)酵液，按1.3.6節(jié)方法進(jìn)行樣品制備，在設(shè)定的儀器條件下進(jìn)行檢測(cè)。橘汁中的檸檬苦素的含量分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖 3 第1(A)、2(B)、3(C)批橘汁樣品中檸檬苦素變化趨勢(shì)圖Fig.3 Changes of limonin in batch 1 (A), 2 (B) and 3 (C) of fermented orange juice

由表2顯示，橘汁在發(fā)酵過(guò)程中檸檬苦素有一個(gè)上升的過(guò)程，基本在主發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬苦素含量逐漸降低。檸檬苦素的變化趨勢(shì)如圖3所示。

3 討論與結(jié)論

3.1 檸檬苦素含量的測(cè)定可用于控制柑橘及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。已報(bào)道的檢測(cè)方法很多, 主要有Davis法、分光光度法、薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)等[8,16-18]。由于檸檬苦素類(lèi)似物配糖體極性強(qiáng)，在提取液中常與許多雜質(zhì)共存，因而對(duì)其檢測(cè)及純化都很困難，多數(shù)檢測(cè)方法效果不佳。對(duì)于柑橘及其加工產(chǎn)品中低含量的檸檬苦素沒(méi)有辦法進(jìn)行精確定量。本實(shí)驗(yàn)采用的UPLC-MS/MS分析方法能夠準(zhǔn)確的定量分析柑橘產(chǎn)品中的檸檬苦素，檢測(cè)限低、樣品處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，能夠用于柑橘及其相關(guān)產(chǎn)品中檸檬苦素含量的分析，控制相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量。

3.2 通常柑橘鮮食無(wú)苦味，但經(jīng)榨汁、殺菌等加工處理后就表現(xiàn)出苦味。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，柑橘發(fā)酵液有一個(gè)明顯的檸檬苦素上升的過(guò)程，該現(xiàn)象印證了橘汁產(chǎn)品的“延遲苦味”。據(jù)研究，柑橘汁出現(xiàn)“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下，果實(shí)中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸堿[19]。

柑橘加工產(chǎn)品出現(xiàn)延遲苦味是柑橘加工業(yè)中比較重要的問(wèn)題，避免苦味的產(chǎn)生或脫除橘汁中的苦味物質(zhì)是提高柑橘加工產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。現(xiàn)常見(jiàn)的脫苦技術(shù)有吸附法、固化霉脫苦法、生物法、β-環(huán)糊精脫苦法、分離法脫苦等[20-21]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾采用自然沉降法，檢測(cè)苦味物質(zhì)的變化?？辔段镔|(zhì)隨時(shí)間從低到高再逐漸降低，也能達(dá)到脫苦的效果，不過(guò)耗時(shí)較長(zhǎng)，但對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)橘子果酒，長(zhǎng)時(shí)間的保存發(fā)酵液能增加產(chǎn)品的厚重感和產(chǎn)品特有風(fēng)味。

3.3 發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件的控制也是橘汁發(fā)酵液產(chǎn)生苦味的一個(gè)重要原因。但無(wú)論如何控制條件，橘子汁發(fā)酵液中的檸檬苦素都有一個(gè)逐漸上升再到慢慢降低的過(guò)程，橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的這種變化趨勢(shì)，將指導(dǎo)橘子酒的生產(chǎn)。取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液勾兌得到橘子果酒，發(fā)酵時(shí)間短的橘子果酒，苦澀味明顯，消費(fèi)者多不接受。360d(一年)后的發(fā)酵液勾兌的產(chǎn)品香味純正，具橘子特有清香、酒體橙黃、澄清透明、酸甜柔和、無(wú)明顯苦澀感，能為多數(shù)消費(fèi)者接受。采用發(fā)酵保藏時(shí)間一年以上的橘汁發(fā)酵液生產(chǎn)橘子果酒，能獲得品質(zhì)較高的橘子酒。

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